乳鼠肾细胞的原代培养.pdfVIP

细胞生物学实验 生64 范泓洋2006030003 乳鼠肾细胞的原代培养及传代培养 生64 班 范泓洋 3006030003 1. 实验目的 a) 掌握原代细胞培养的原理与操作方法，了解无菌操作的条件和注意事项； b) 了解并通过实践学习处死与解剖乳鼠和识别、取出乳鼠肾脏的方法； 2. 实验原理 新生约3 天的乳鼠体内的组织与器官均没有发育成熟，处于旺盛的分裂生长 时期，因此是用作细胞培养的良好材料，适当的培养就可以观察到贴壁和分裂增 殖现象。由于肾脏的细胞类型较为单一并且肾脏本身易于从乳鼠体内取出，将肾 作为实验材料是较好的选择。 在进行细胞培养之前，首先要从组织中提取出大量的分散的单细胞并制备成 细胞悬液。这就需要首先破坏细胞外基质以及细胞连接对组织细胞的“束缚”。 胚胎或新生动物的组织中细胞外基质和细胞连接并没有充分形成，这也是将新生 动物作为实验材料的原因之一。具体的方法是用蛋白酶例如胰蛋白酶（trypsin） 或胶原酶（collagenase）和乙二胺四乙酸（EDTA）处理组织，使之成为单细 胞。胰蛋白酶作用于肽链的Lys 或Arg 残基的羧基末端，将肽链水解为长短不 同的几段；在胎儿发育过程中活性很强的脊椎动物胶原酶（vertebrate collagenase）能够催化胶原蛋白在Gly-Leu 和Gly-Ile 键处水解，将其裂解为 一个较大的N 端片断（75%）和一个较小的C 端片断（25%）。这两种酶可以 达到有效降解细胞间质蛋白的目的。EDTA 是钙离子螯合剂，而Ca2+在细胞粘 连中起到了关键性的作用，去掉有助于肾细胞脱落。用酶解的方法能够使细胞从 原有组织中脱落并保持生命力，本实验正是采用了这样的方法。 1 细胞生物学实验 生64 范泓洋2006030003 3. 实验材料、用品和仪器 超净工作台、倒臵显微镜、二氧化碳培养箱、水浴锅、高压灭菌锅、离心机、 滤器 酒精灯、酒精棉、镊子、器械缸、废液缸、记号笔，蜡盘、大头针、眼科剪、 眼科镊，移液器架、移液器、吸头，试剂瓶、试剂瓶架，平皿、细胞培养瓶、离 心管等 PBS 溶液，0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA 溶液，DMEM 培养基（含 10% 小牛血清及双抗） 4. 实验步骤 4.1 将乳鼠（3 天左右）断头放血致死。 4.2 进入无菌间，用70%乙醇消毒乳鼠体表，将其固定在蜡盘上。 4.3 在超净台内，将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口，然后皮肤拉开，固定 在蜡盘上。将其腰背部肌肉暴露出来。用70%乙醇消毒背部肌肉，在脊柱两侧 各剪一切口，取出肾脏，臵于盛有 PBS 溶液的平皿中，除去肾膜与脂肪。 4.4 将肾脏中剪成数块，用PBS 溶液再洗涤一次。 4.5 吸去PBS 溶液，将肾脏剪碎。 加入0.5mL 胰酶—EDTA 溶液，于37℃ 消化20 分钟，直至组织块变白、呈疏松状 4.6 加入0.5mL 含血清DMEM 培养基终止消化，反复吹打分散细胞 4.7 1 000rpm 离心 10min，弃上清。 4.8 加入 1mL含血清DMEM 细胞培养液重悬细胞，将细胞悬液转移至细胞培 养瓶中，于 37℃、5% CO 培养 2 4.9 一天后，观察细胞生长及贴壁状态。向培养瓶中加入 1mlPBS 溶液洗涤一 2 细胞生物学实验 生64 范泓洋2006030003 次，将PBS 吸净后加入1ml血清DMEM 细胞培养液，继续于 37℃、5% CO2 培养 4.10 三天后观察细胞生长情况，进行传代培养。将细胞培养瓶中培养基洗净， 加入200μl 胰酶—EDTA 溶液，于37℃消化5 分钟，加入800μl 含血清DMEM 细胞培养液终止消化，反复吹打分散细胞。5 000rpm 离心5min。吸净上清， 向沉淀中加入1ml含血清DMEM 细胞培养液，吹打使重悬。向两个