第13章核酸的结构与性质.pptVIP

cAMP(3’,5’-环化腺苷酸)和cGMP(3’,5’-环化鸟苷酸)的主要功能是作为细胞的第二信使。 cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键。在pH7.4, cAMP和cGMP的水解能约为43.9 KJ/mol，比ATP水解能高得多。 （1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5′端→3′端，而另一条链的方向为3′端→5′端。 （2）嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90°角。 （3）维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:A与T结合，G与C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。 RNA几乎都是单链分子，因此在RNA分子中，嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。 RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。 除rRNA外，其他RNA很少与蛋白质结合。 DNA的热变性 解链曲线：当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。 1、DNA分子的大小 : 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2、琼脂糖浓度 : 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 3、DNA的构象: 超螺旋环状＞线状＞切口环状。 4、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭: 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 5、所用的电压: 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围 核酸的种类、核苷酸的种类、脱氧核苷酸和核糖核苷酸的分子区别、核苷酸分子的形成。 核酸分子一级结构连接方式、书写方式。 简述DNA二级结构的特征、 DNA三级结构和四级结构是怎样形成的？ RNA分子的高级结构的特点。 什么是核酸变性？变性因素有哪些？ 什么是核酸的解链温度Tm？影响因素有哪些？ 核酸退火、高色效应、减色效应、核酸分子杂交的定义。 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲电泳主要分离多大的核酸分子？ 双脱氧终止法测序的原理和读板。 ● 1个核苷酸对（A.U），浓度为Co=1.0mmol/L。 则50%复性时，Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒 复性100%，Cot=10-4 mol.s/L ， t=0.1秒 ●E.coli 4.2×106碱基对，浓度Co=1.0 umol/L。 复性50%时， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，约115天 复性100%时，Cot=500 mol.s/L ，t=5×108秒，5758天 复性动力学曲线 复性速度可用Co·t衡量。Co为变性DNA原始浓度(mol·L-1)，t为时间(秒)。根据复性动力学曲线可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数。 (三) 分子杂交 分子杂交的原理示意图 在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。 一）核酸的超速离心 原理：由于不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋）的密度，所以在溶液中的浮力密度也不同，即沉降速率不同，当把核酸溶液进行超速离心时，不同大小的核酸因福利密度的差异而被分开。常用的溶液有CsCl，蔗糖、甘油等。 五、核酸的分离与纯化 浮力密度： RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质 变性程度越大，浮力密度越大 二）核酸的凝胶电泳 （一）琼脂糖电泳（agarose gel electrophoresis） 用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。 DNA的迁移速率决定因素 0.01~0.1 6.0 0.1~0.5 4.0 0.5~1 0.05~1 3.0 0.1~3 0.1~3 2.0 0.2~4 0.2~4 0.08~4 1.5 0.3~7 0.3~7 0.15~6 1.2 0.4~8 0.4~8 0.25~12 1.0 0.8~10 0.8~10 0.5~15 0.8 0.7~25 0.5 1~50 0.3 低