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流式细胞术及其应用 分子生物学研究中心 贾宇臣 第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍 概念 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单 细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特 定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算 机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的 一种新型高科技仪器。 流式细胞仪特点 FACSCalibur BD LSR FACS Vantage DiVa FACSAria 流式细胞仪检测范围 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究 流式细胞仪的工作原理 激光光源 单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子激光器或氦氖激光器 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光 最多检测13个荧光参数 细胞分选系统 信号检测--散色光 信号检测--荧光信号 数据显示类型 光谱交叉 荧光补偿方法 抗体使用原则 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC 使用双标以上抗体必做荧光补偿 第 二 部 分 流式细胞术在不同领域的应用 细 胞 周 期 分 析 样品制备 建立获取模式，获取数据 （PI单染分析细胞周期，同时看凋亡） 数据分析 细胞凋亡分析 Annexin V-PE/7-AAD双染色法 人外周血淋巴细胞亚群检测 结束语 流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们的宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研等领域，报告最科学、最真实的客观数据，以服务于全社会。 样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 单细胞 悬液 标记 荧光抗体 检测 表型测定 细胞分选 流式细胞术操作流程 统计学 分析 继续 培养 1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞 PBS漂洗 两次 70%酒精 4度固定过夜 收集固定的细胞 PBS漂洗 0.5 PBS 悬浮细胞 2.5μl 10μg/μl RNase A 37度消化1小时 过300目细胞筛 50μl 0.1mg/ml PI（含1%Triton)， 1000rpm 5分钟 离心 两次 混匀，室温 静止5分钟 上机 去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用 圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡 圈门去除粘连体，分析细胞周期 双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞 双阳：晚期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞 T淋巴细胞 T淋巴细胞检测 淋巴细胞 CD4+T（Th)淋巴细胞检测 淋巴细胞 CD4+ CD8+Ts淋巴细胞检测 淋巴细胞 CD8+ B淋巴细胞检测 淋巴细胞 B淋巴细胞 * * 单细胞悬液或生物颗粒 分析速度高 多参数 精度高 当代最先进的细胞定量分析技术 特点： 光路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 使用寿命长 配备1-2根激光 细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析 临床型（台式机） 科研型（大型机） 特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选 科研型 特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板） 适用于高速分选和多色分析 细胞结构 特异性抗原 （细胞表面/胞浆/核） 细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞功能 光学系统 激光光源 光收集系统 液流系统 流动室 液流驱动系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统 Longpass Shortpass Bandpass 460 500 540 460