获取靶基因的方法选读.ppt

适用于简单的原核生物的基因的获取 Dear Dr. Kreutz, I am studying the mechanism of soluble MHC class I release mediated by the metalloproteinase pathway in Dr.Yuri Bushkins lab. ADAM19 is one of our candidate metalloproteinases. From your paper, I noticed that you have human ADAM19 cDNA cloned into pcDNA 3.1/V5 vector. So, would it be possible to obtain from you this plasmid? Thank you very much. Yours sincerely, Dr.Jinrong Zhao Room W350T.1 UMDNJ-PHRI 225 WarrenStreet Newark，NJ 07103 USA 教学要求 * 你所感兴趣和想研究的基因，称为目的基因。 第四章 靶基因的获得 直接分离DNA 基因组文库或cDNA文库筛选 PCR或RT-PCR扩增目的基因 人工合成较短的DNA片段 直接分离DNA 需要克隆的DNA片段 DNA文库 cDNA文库 构建基因文库筛选目的基因 基因文库 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA集合 克隆集合 化学合成法合成基因 适用条件： 分子量较小的目的基因； 采用传统钓取法较困难的基因（如丰度较低的基因）； 自然界不存在的基因； 密码子需优化的基因等…… 合成方向：3’ 5’ 合成效率：97-98%/步 引物纯化：PAGE 全基因合成：合成，退火，连接 补充一些常识： 应用PCR获取目的基因 Thp1细胞 mRNA cDNA PCR MMLV反转录酶 TaqDNA聚合酶 例:ADAM10 gccAAGCTTcagcggaaga tggtgttgct ttaCTCGAGcggcgtctcatgtgtcccatttg HindIII XhoI PCR产物 载体 HindIII和XhoI双酶切消化 索要靶基因 掌握：如何用PCR法获取目的基因 熟悉：人工合成DNA片段方法 了解：直接分离DNA和基因组文库或cDNA文库筛选获取靶基因方法 这是cDNA文库构建的流程图，请一位同学简单介绍一下这个流程。从cDNA文库筛选……流程 也就是到DNA合成公司如上海生物工程公司,这种方法偶尔会用到。 情形1：…… 很多方法能帮助我们从基因文库的众多克隆中筛选和鉴定带有特定基因的克隆，它们大多是以杂交探测技术为基础的。 Plate membrane 转膜 标记 因为我曾经具有操作DNA合成仪的经验，所以这里想给大家补充一些有关DNA合成的一些常识，知识一是： 化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp，合成，退火，连接 这种方法我至今没用到过。其简单过程是：通过对原核生物的基因进行限制性内切酶分析，选用合适的限制性内切酶把目的基因切割出来。 从基因文库筛选目的基因这种方法至今我也没用到过。我以cDNA文库为例来简单介绍这种方法。 下面重点介绍如何应用PCR法获取目的基因。我们以ADAM10基因获取为例。 给大家看一下我设计的引物；保护碱基 保护碱基：限制性内切酶切割对切点附近的DNA长度有要求…….提高切割效率 * * *