细胞融合与单克隆抗体课稿.ppt

葡萄刺玫 * 柠檬柚，甜瓜是香瓜和哈密瓜的杂交 * 神经氨酸酶降解细胞膜糖蛋白 * 细胞融合前的准备（2） 制备饲养细胞（feeder cell）：小鼠腹腔巨噬细胞，能分泌生长因子促使单个细胞容易生长，还能清除死亡破碎细胞及微生物。 于细胞融合前一天，取SPF 级健康Balb/c 小鼠，处死，用75%酒精浸泡10 min，消毒小鼠体表。 将其移入超净工作台内，以仰卧位固定在解剖板上，用无菌注射器吸取10 ml1640液注射入腹腔，用酒精棉球轻揉腹部2～3 min；用无菌剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，吸出腹腔液，放入10 ml离心管，1 000 rpm，离心10 min，弃上清； 用5 ml HAT培养基重悬细胞，计数调整细胞数1×105/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔100 μl，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。 一般一只小鼠可获得5×106～8×106个饲养细胞，用于3块96孔板融合细胞培养。 细胞融合前的准备（3） 骨髓瘤细胞悬液的制备： 细胞融合前两周复苏小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，待细胞生长稳定后，以终浓度为20 μg/mL 8-AZ完全培养液培养两周，筛选HGPRT缺陷型细胞。 融合前48 h将SP2/0 细胞进行传代培养，选取对数生长期的细胞，于融合前用新鲜培养液换液一次，融合当天收集细胞悬液，离心弃上清，用1640液洗涤一次，重悬于培养液中，计数细胞总数。 细胞融合前的准备（4） 免疫鼠脾细胞悬液的制备： 处死一只免疫好的Balb/C小鼠，小鼠用75%酒精浸泡10 min； 无菌操作取出脾脏，放入盛有10 ml不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的结缔组织和脂肪组织。然后换一新玻璃皿，加入1640液30 ml，将脾脏置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，期间用不完全培养基冲洗数次，使脾细胞穿过网孔进入溶液中； 将脾细胞移至10 ml玻璃离心管中，1 000 rpm，去上清，用不完全培养基10 ml洗涤细胞3次，离心收集脾细胞；将脾细胞用10 ml不完全培养基重悬混匀，计数，置室温待用。 细胞融合 融合前将50% PEG置于37℃培养箱中预温； 吸取SP2/0细胞悬液和脾细胞悬液至一个50ml离心管中，使脾细胞∶骨髓瘤细胞 = 10∶1，充分混匀，1 000 rpm离心10 min，弃上清； 吸取0.7 ml 50%PEG，离管底约2 cm处沿管壁加入PEG，1min左右加完，静置90s；逐滴加入37℃预温的不完全培养基1ml，再吸取不完全培养基10 ml，缓慢加入，最后加入20ml不完全培养基； 800 rpm，离心8 min，弃去上清，加入HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀；将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，每孔100 μl； 每块培养板留3~5孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃、5% CO2培养箱中培养。 PEG介导细胞融合的机制 提高融合率的技术措施 饲养细胞的加入有助于促进杂交瘤细胞的生长。 PEG浓度要准确：PEG在50～60℃时仍为液体状态，含DMSO的1640液要保温50℃，两种液体混合时一定要充分混匀； 当脾细胞和瘤融合时，末次离心后应尽量吸出上清，可避免对PEG的稀释作用； 由于PEG能引起蛋白质的沉淀，故脾细胞、瘤细胞需经不含小牛血清的1640液的洗涤。 PEG作用瘤细胞和脾细胞融合后，加入无血清1640液时要控制好速度，否则当渗入的液体太快，细胞可能胀破；融合后离心速度不要太高，一般为800 rpm，5 min。 细胞融合时，脾细胞∶骨髓瘤细胞的比例一般为5～10∶1，每孔接种的细胞大约为1×105～2×105，接种过多，容易在单孔内形成多个克隆集落，不利于克隆化操作。 杂交瘤细胞的筛选： HAT培养基 融合后每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并于第5天每孔半量换液HAT培养基100 μl。 杂交瘤细胞融合情况观察 4d 10d 9d 7d 5d 抗体特异性筛选： 融合后10天～14天，细胞克隆长至孔底的1/3～1/2时，即可采用间接ELISA法检测各细胞培养孔上清液，筛选分泌目的抗体的阳性克隆。 挑出融合板阳性孔细胞，加入8-10 ml HT培养基，混匀铺板4-6纵行，待亚克隆生长5-7天，克隆长大约1万个细胞以上/孔，再用 ELISA方法检测。 再次筛选出阳性克隆后，立即采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞进行单细胞分离培养。 筛选分泌特异Ab的杂交瘤细胞新方法： electro-FACS-fusion 单独筛选分泌某种抗体（如IgM型）的杂交瘤细胞 磁性颗粒筛选 免疫渗滤法 克隆化： 有限稀释法：逐步稀释使平均每孔只有一个细胞。 收集阳性克隆细胞，