细菌内毒素检查标准程序.docVIP

细菌内毒素检查标准程序 1.目的：建立细菌内毒素检查标准程序，指导规范操作。 2.范围：适用于各种供试品的细菌内毒素—凝胶法检查。 3.职责：检验人员对本规程的实施负责。 4.编制依据：2010年版《中华人民共和国药典》二部附录细菌内毒素检查法中的“凝胶法”。 5.原理：凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 6.程序： 6.1试验材料与用具 6.1.1仪器与用具： ①可调式微量移液器（50～250μl、200～1000μl）；无热原枪头（250μl、1000μl）无热原空安瓿瓶或用经250℃干烤至少60分钟刻度吸管（1ml）、10mm×75mm试管。 ②恒温水浴锅、快速混匀器、砂轮、温度计、试管架、封口膜。 6.1.2细菌内毒素检查用水：凝胶法细菌内毒素检查用水是指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。 6.1.3细菌内毒素标准品：细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品 6.1.4鲎试剂 6.2鲎试剂灵敏度复核： 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。 注意：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 6.2.1取细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，用砂轮轻轻在要开启处划痕，用75%酒精擦净后开启。 6.2.2用可调式微量移液器或刻度吸管取定量的细菌内毒素检查用水沿细菌内毒素标准品瓶壁加入，用封口膜将瓶口封严，在旋涡混合器上混匀15分钟。 6.2.3根据鲎试剂的标示值（λ），用细菌内毒素检查用水对上述已溶解混匀的细菌内毒素工作标准品溶液进行倍比稀释，制成2.0λ，1.0λ，0.5λ,0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液。每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。 6.2.4取标示量为0.1ml的鲎试剂18支或其他标示量的鲎试剂适量，轻轻敲打瓶壁，将附着在瓶颈上的内容物弹下，用砂轮在瓶颈处划痕，用75%酒精擦净后开启。 6.2.5根据鲎试剂的标示量，用可调式微量移液器或刻度吸管取细菌内毒素检查用水适量加入各鲎试剂管中，轻轻晃动，使鲎试剂完全溶解避免产生气泡。将其他标示量的鲎试剂溶液分装至18支10mm×75mm试管中（每管0.1ml）。 6.2.6上述18支装有0.1ml鲎试剂溶液的安瓿或试管，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。 6.2.7将各管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37±1℃恒温水浴锅中，保温60±2分钟。 6.2.8 将各管从恒温水浴中轻轻取出，缓缓倒转180°，观察： 若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性。 管内未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。 注意：保温和拿取试管或安瓿的过程中应避免受到振动造成假阴性结果。 6.2.9结果计算： 6.2.9.1当最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照管均为阴性，试验方为有效。 6.2.9.2按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）： λc=lg-1（∑X/4）（EU/ml） 式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 6.2.10结果判断： 当λc在0.5λ~2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 否则，该批鲎试剂判为灵敏度不合格，不可用于细菌内毒素检查。 6.3供试品溶液的制备： 6.3.1一般要求供试品溶液的pH值在6.0~8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液或其稀释液的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节。酸或碱溶液必须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 6.3.2供试品内毒素限值的确定： 一般按以下公式确定：L=K/M 式中：L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示； K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）； M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。 按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要的调整，但需说明理由。 6.3