生物制药工艺学实验3教材.ppt

请各组同学收拾自己的玻璃器皿和台面； 请第三组同学打扫卫生。 南京师范大学生命科学学院 张茵 2015年4月 实验三 超滤法分离溶菌酶和盐析  浓缩溶菌酶 实验目的 掌握超滤分离技术的原理和操作； 掌握盐析的原理和操作。 实验流程 超滤法进一步分离溶菌酶 透过液盐析法沉淀溶菌酶 透析法除盐 实验材料 溶液：0.5M NaOH溶液 透析缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0） 其他材料：透析袋（8000~10000Da），超滤膜（30kD），固体硫酸铵，研钵，捣杵等。 实验原理 超滤分离技术 原理：它是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。它是一种流体切向流动和压力驱动的过滤过程。 2、分离方式：切向流过滤 切向流过滤：溶液沿与超滤膜平行的方向流动，可避免浓差极化，提高超滤速度。 封头过滤：溶液流动方向与过滤方向一致，随着过滤的进行，膜表面形成的滤饼层厚度逐渐增大，流速逐渐降低。 3、超滤分离过程示意图 4、选择超滤膜 截留分子量：阻留率达90%以上的最小被截留物质的分子量。 膜的材质：非特异性吸附低，耐酸碱性好。 Hydrosart膜：纤维素衍生膜，对蛋白质非特异性吸附低，在pH2-14酸碱度范围内使用，可以用1N NaOH 清洗再生多次，流量恢复率高。 5、超滤的基本流程 选择合适的膜包（考察膜的截留分子量等）； 将膜包固定在夹具中（不超过膜的耐受压力）； 选择合适的切向流速率（不超过膜包的最大允许背压）； 超滤结束后要冲洗膜包； 观察回流液速率，确定是否预过滤溶液。 观察水透过通量，适时清洗膜包； 膜包需保存在含防腐剂的溶液中。 盐析沉淀蛋白质 原理： 大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，使蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，蛋白质相互聚集而沉淀。 大量的盐离子能够中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质之间的静电斥力降低，导致蛋白质相互聚集而沉淀。 由于蛋白质分子的水化膜被破坏，暴露出其疏水区域，蛋白质的疏水区域越多，越易沉淀。 2、优点：较少引起蛋白质变性； 3、缺点： 在盐析过程中，易产生共沉现象，故分辨率不高； 盐析后需进行脱盐步骤。 4、注意事项： 蛋白质浓度可适当降低，以减少共沉； pH值一般选择在蛋白质的等电点附近，盐析效率高； 在高盐下，蛋白质的溶解度一般随温度的升高而降低，因此，通常盐析在室温下进行盐析。 透析除盐 1、原理：在常压下，依靠小分子物质的扩散运动将两类分子量差别较大的物质分离开来。 2、注意事项 透析袋要留一定空间，以防透析袋胀裂，和因透析袋膨胀引起膜孔径的变化； 透析装置常加上搅拌系统，并定期或连续更换新鲜的溶剂，以提高透析效率。 3、透析袋：一般是再生纤维素，具有亲水性、惰性和良好的物理性能，可再生。 4、透析袋的预处理：50％乙醇煮沸1h，再分别用50％乙醇、0.01mol/L NaHCO3 和0.001mol/L EDTA溶液依次洗涤，最后用蒸馏水浸洗，存放与70％乙醇溶液中。 透析示意图 实验步骤 超滤分离（四组同学的溶菌酶洗脱液合并超滤）：将溶菌酶洗脱液以合适的流速经过超滤膜（进口压力不超过 2.0bar ），收集透过液，回流液（吸取 200μL于dorf管中，标记为“6”），当透过液与回流液体积比约为3:1时，超滤可结束。 超滤结束后，需要用50mM 磷酸缓冲液冲洗膜包；当透过液与回流液体积比约为1:1时，冲洗即可结束。 如果透过液流速减慢，需要用0.5M NaOH溶液清洗膜包，然后再用蒸馏水将碱液冲洗干净。 2、盐析：在透过液中加入研细的固体硫酸铵粉末（边搅拌边加入），硫酸铵的终浓度为35％（即100mL 溶液中 35g 硫酸铵），室温下静置约20~30min，4度、10000rpm、20min。 3、透析除盐：取少量 0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）溶解沉淀，装入透析袋中，置于适量的0.1M 磷酸钠缓冲液室温下搅拌透析过夜，次日更换缓冲液继续透析24h。透析结束后，将透析袋内的溶菌酶样品装入离心管中，4度保存备用（标记“7”）。 超滤是一种温和的、非变性的物理分离方法。透过液含有水、离子和小分子物质，而胶体物质、颗粒、细菌、病毒和原生动物将被膜去除。超滤膜孔径大小的切割分子量范围一般在1000-500000之间。超滤膜的运行压力一般1-7bar。 总之，它是一项分子级薄膜分离 手段，它以特殊的超滤膜为分离介质，以膜两侧的压力差为推动力，将不同分子量的物质进行选择性分离。 应用：反渗透预处理、饮用水制备； 纯化小分子产品，如柠檬酸、抗生素和氨基酸等。 在医药和生化工业中用于处理热敏性物质，