武汉大学博士论文节选解剖.pdf

基于生物大分子/碳酸钙杂化纳米粒子的功能化基因及药物传递系统 的研究 武汉大学博士论文节选，2014 摘 要：基因传递是指将治疗基因传递至生物体内特定组织及细胞、从而达到治疗基因相关 疾病的效果,在肿瘤等重大疾病治疗方面具有独特的优势。药物传递的目的是最大限度地在 病患部位发挥药物疗效、同时降低药物对正常组织的副作用。在药物和基因传递方面,高效 安全的基因和药物载体具有重要的意义。本论文的研宄主要集中在功能化生物大分子/碳酸 钙基因及药物传递系统,通过引入生物大分子鱼精蛋白、功能多肽等对基于碳酸钙的纳米粒 子的基因及药物传递体系进行改性,提高其基因及药物传递性能。 在第一章中,简述了基因与药物传递系统的研宄现状。介绍了用于介导基因传递的非病 毒载体、实现靶向基因治疗的各种方法,以及肿瘤细胞的多药耐药性的产生原理及其逆转手 段。 在第二章中,通过引入一种天然存在的富含精氨酸序列的生物相容性阳离子多肽鱼精蛋 白(PS),制备得到了生物相容性良好的PS/CaC03/DNA共沉淀纳米粒子。测量了 PS/CaC03/DNA 纳米粒子的粒径和;电位,考察了 PS/CaC03/DNA纳米粒子介导pGLuc-3质粒在含10%牛血清 蛋白的培养基中对293T细胞和HeLa细胞的基因转染效率,以及转染后的细胞存活率。用共 聚焦显微镜观察了不同纳米粒子介导HeLa细胞转染4h和24h后的细胞形貌。结果显示,与 未经修饰的PS/DNA纳米粒子和CaC03/DNA纳米粒子相比,PS/CaC03/DNA纳米粒子的基因传 递效率更强,粒径降低,稳定性增加。此外,与商业化脂质体基因载体Lipofectamine2000相 比,PS/CaC03/DNA纳米粒子的基因表达水平比Lipofectamine2000/DNA更高。为了进一步考 察碳酸韩纳米体系介导的基因转染的效率,还使用了另一种报告基质粒pEGFP-Cl研宄了不同 纳米粒子的转染活性,并用流式检测仪测量了其基因传递性能。流式检测仪的检测结果进一 步证明了 PS/CaC03/DNA纳米粒子具有良好的基因传递效果。 在第三章中,为了进一步提高载体的基因传递效率,在基因传递体系中同时引入了鱼精蛋 白和细胞穿透肽KALA多肽,制备了双功能化的KALA^S/CaCOs/DNA纳米粒子。为了便于比较, 同时制备了仅含鱼精蛋白或KALA多肽的单功能化的纳米粒子,测定了 KALA/PS/CaC03/DNA 纳米粒子的粒径、I;电位,与未经修饰的 CaC03/DNA 纳米粒子相比,制备得到的 KALA/PS/CaC03/DNA纳米粒子的粒径降低,;电位增加。考察了KALA/PS/CaC03/DNA纳米粒子 在含10%牛血清蛋白的培养基中对293T和HeLa细胞的基因传递效率及其影响因素,结果表 明,与未改性的 CaC03/DNA 纳米粒子和仅含 PS 或 KALA 多肽的单功能化纳米粒子相 比,KALA^S/CaCOa/DNA纳米粒子的基因转染效率明显提高。激光共聚焦显微镜观测结果显示 双功能化的KALA/PS/CaC03/DNA纳米粒子更易进入细胞和更好的核转运效果,因此其基因转 染效率有明显提高。在第四章中,通过生物素-亲和素作用,在含有生物素化肝素(HPB)的基因 传递体系引入了一种同时含有肿瘤细胞靶向的RGD序列和增强细胞摄入的R8序列的生物素 化多肽GS-14,通过水溶液中的自组装制备了同时具有肿瘤靶向和细胞穿膜作用的多肽功能 化 GS-14/Avidin/HPB/PS/CaC03/DNA 纳 米 粒 子 , 测 量 了 制 备 得 到 的 GS-14/Avidin/HPB/PS/CaC03/DNA纳米粒子的粒径、g 电位,考察了其对HeLa的体外转染效果, 测定了转染后的细胞存活率,并用共聚焦显微镜观察了其转染细节。结果显示,多肽功能化的 纳米粒子的细胞转染能力明显提高,且对肿瘤细胞HeLa具有靶向性。 在第五章中,为了克服肿瘤细胞耐药性,制备了负载抗癌药物阿霉素盐酸盐(DOX)的 PS/CaC03/D0X 纳米粒子、以及同时负载 DOX 和耐药抑制剂 Tariquidar(TQR) 的 PS/CaC03/D0X/TQR纳米粒子协同药物传递系统。测量了其粒径、;电位’考察了纳米粒子对 MCF-7/Adr耐药细胞的生长抑制效果。结果显示,与游离药DOX和CaC03/D0X纳米粒子相 比,PS/CaC03/D0X纳米粒子对耐药细胞的抑制效果明显增强。与DOX和TQR 的游离