人肌酸激酶MM同工酶在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化研究.pdfVIP

人肌酸激酶埘同工酶在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化研究 黄燕杨文双徐国宾夏铁安 (北京大学第一医院检验科100034) 【摘要】目的构建肌酸激酶姗同工酶原核表达系统，纯化重组酶蛋白并对其稳定性进行 研究，为其作为参考品或校准品应用于临床奠定基础。方法提取胎儿心肌组织总RNA，反 以用异丙基一B—D一硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。利用重组蛋白中的组氨酸 标签(His—tag)进行金属螯合亲和层析纯化，观察重组酶在不同保存条件下的稳定性。结 果重组质粒经酶切及测序鉴定与预期相符，诱导表达后细菌裂解液上清酶活性可达28X i04 功表达并纯化了人肌酸激酶删同工酶，重组酶稳定性良好，初步具备了作为基因工程人源 酶校准品的基本特点。 【关键词】人肌酸激酶删同工酶；酶校准品；可溶性表达：金属螯合亲和层析：稳定 肌酸激酶(creatinekinase：ATP：creatine 主要存在于动物的心脏、骨骼肌及脑组织的细胞质和线粒体中，参与细胞内能量转运、肌肉 收缩、ATP再生等过程幅’。胞质型肌酸激酶为二聚体酶，由M、B亚基分别聚合为姗、船、 BB三种同工酶形式。M型亚基由381个氨基酸组成，分子质量为43．ikDa。从19世纪50年 代，血清总CK催化活性浓度用于心肌、骨骼肌和脑疾患的诊断和鉴别诊断及预后判断，是 测定次数最多的诊断用酶之一。和其它诊断用酶一样，不同实验室间CK活性测定的变异系 数较大锄(可达33％)，这与其自身的生物学特性及测定方法有关，主要构成CK活性中心的 所以在反应体系中加入了“复能剂”N一乙酰半胱氨酸，不同反应体系中N一乙酰半胱氨酸量 的不同会影响酶活性测定结果。在诸临床诊断用酶中，CK连续监测法测定过程偶联反应最 多，整个反应体系中包含三步偶联反应十二种试剂组分，测定过程的复杂影响了结果的一致 性，所以，实现酶测定标准化是临床亟待解决的问题之一。 目前，国内外普遍认可的酶标准化方法是建立参考实验室网络，由参考实验室使用参考 测定程序为酶参考物定值，生产商利用此参考物校正检测系统，为商业化校准品或质控品赋 值，再用于校正临床实验室测定，实现将测定结果的准确性从参考方法至常规方法的传递“’。 ．．592． 国外CK活性测定的参考测定程序是由IFCCl998年推荐连续监测法(37℃)，酶学参考实验室 主要包括欧美日十四家实验室，共同认证的cK参考物为IRMM-ERM-AD455，是由人心肌组 织提取的cK一船同工酶。其它通过认证或已溯源的参考品或校准品主要包括Roche公司的由 和人胎盘组织提取的CK-BB同工酶等。在我国，中华医学会检验学会酶学组2004年在南京 召开的会议上已将IFCC参考测定程序确定为我国CK活性测定的参考方法，参考实验室的建 立工作也在卫生部临检中心及北大医院等开始启动，但我国尚未有可推荐的参考品或校准 品。所以，获得稳定性高，互换性好，可大量生产的酶参考品或校准品是我国实现酶测定标 准化工作的关键环节之一。国内外公认的酶参考物或校准品主要有三种来源：(1)动物源性； (2)人类组织、细胞或分泌物提纯：(3)源于基因工程的人源酶制品。动物源性酶制品的 最大优势是来源容易，酶的催化特性与人类相似，最大的缺点在于其种属特异性，动物源性 酶的反应性与人源酶不可能完全相同，在应用时可能存在更多的酶的互换性问题。由人组织、 细胞或分泌物提纯的酶制品，虽然酶的性质得以保证，但由于涉及伦理问题，另外也存在着 病原体的潜在污染，所以在应用时受到了一定的限制。来源于基因工程技术的酶参考品由于 保证了批间重复性和较好的酶互换性，适合于作为生物制品大量生产而越来越多的应用于酶 参考品的制备。本研究的目的是构建肌酸激酶M亚基的原核表达系统，得到纯度和活性较高 的肌酸激酶删同工酶，为其作为基因工程人源酶校准品或质控品应用于我国肌酸激酶测定 的标准化工作奠定基础。 l材料与方法 1．1仪器与试剂恒温振荡摇床购于江苏太仓实验设备厂：发酵罐购于Bio—Rad公司、蛋 7、E．coli 及蛋白分子量标准购自华美公司，pBlueScriptSK(+)质粒、E．coliToplOF DNA聚合酶由北京大学第一医院卜定方教授提供，限制性内切酶购自 BL21(DE3)plysS、Taq 由北京奥科公