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对壳聚糖纳米粒在气道粘膜粘附性的实验研究 　　摘要：目的 通过在体和离体实验研究壳聚糖纳米粒在气道粘膜的粘附性。方法 通过雾化吸入和灌洗的方式将荧光标记的壳聚糖纳米粒作用于气管、支气管和肺组织上。在激光共聚焦显微镜下观察壳聚糖纳米粒的粘附情况并考察其在气道粘膜上的滞留时间。结果 壳聚糖纳米粒组和载胰岛素壳聚糖组在气管、支气管及肺组织上的荧光强度比较无明显差异，P0.05；胰岛素组与其他两组的荧光强度相比有明显差异，P0.05。壳聚糖纳米粒在雾化后30 min、2 h、5 h、8 h通过激光共聚焦显微镜可见气管、支气管、肺组织均有荧光显示。结论 壳聚糖纳米粒与气道粘膜具有粘附性；其在气道粘膜上的滞留时间可以达到8 h以上。 　　关键词：壳聚糖；纳米粒；气道粘膜；粘附性 　　肺部吸入给药是将药物直接传递到肺部、产生局部或全身治疗作用的给药方法。具有将药物直接在肺部起效、并能使肺部疾病的药物剂量降低及减小药物的副作用的优点[1]。但是肺部是机体呼吸场所，外界的异物主要依靠粘液纤毛机制来清除，尤其是不溶性微粒[2]，这是影响肺部给药的关键因素。?ぞ厶悄擅琢＝?生物粘附性和药物缓释特性集于一体，使其在定位、缓释、提高生物利用度等方面具有显著优势[3]。壳聚糖纳米粒作为药物载体在口腔、胃肠道等部位的应用已经得到了广泛的研究，然而在与呼吸道粘膜粘附性的研究方面，国内外的报道较少。本研究以新西兰大白兔为实验对象，利用壳聚糖纳米粒生物学特性，研究壳聚糖纳米粒与呼吸道粘膜的粘附性，观察比较壳聚糖纳米粒在气管、支气管及肺组织的粘附性情况，为壳聚糖纳米粒作为药物载体肺部给药及作用于肺内局部疾病的治疗提供理论依据，具有重要的临床应用价值。 　　1资料与方法 　　1.1实验动物 同系交配纯种白色新西兰大白兔 大连大学实验动物中心提供。 　　1.2实验材料及仪器 壳聚糖（CS）购自阿拉丁；异硫氰酸荧光素（FITC）、N-羟基琥珀酰亚胺、2，3-环氧-1-丙醇购于Sigma公司；磁力搅拌油浴（上海越众仪器）；高速离心机（日立）；冷冻干燥机（北京博医康）；超声波雾化器（鞍山电子医疗器械厂）；激光共聚焦显微镜（德国）。 　　1.3方法 　　1.3.1壳聚糖纳米粒的制备及荧光标记 　　1.3.1.1壳聚糖的疏水改性 取纯化后的壳聚糖，分散于200ml超纯水，滴加冰乙酸使壳聚糖完全溶解，置入60℃水浴预热。取DCA、EDC?HCl和NHS于150 ml烧杯、加入100 ml无水DMSO，反应30 min，加到60℃并反应24 h。取出反应完毕的壳聚糖溶液，加入一定量的无水甲醇，用浓氨水调pH至中性，迅速将悬液于8000 rpm离心10 min收集沉淀，最后于烘箱中烘干，最终得到淡黄色粉末状疏水壳聚糖。 　　1.3.1.2疏水壳聚糖的亲水改性 将疏水改性后的壳聚糖样品，分散于超纯水，滴加冰乙酸使壳聚糖溶解，60℃水浴预热，逐滴加入环氧丙醇，搅拌反应24 h。用4M NaOH溶液调pH至8左右，于8000 rpm下离心10 min，然后将上清液置入8 K～14 K透析袋中对大量去离子水透析48 h。最后将样品冷冻干燥，最终得到白色棉絮状的两亲性壳聚糖。 　　1.3.1.3两亲性壳聚糖的荧光标记 取两亲性壳聚糖超纯水，加入NaHCO3和Na2CO3粉末得0.25M碳酸盐缓冲体系，最终pH=9.5。精确称取5 mg FITC溶于5 ml甲醇后在搅拌下逐滴缓慢加入两亲壳聚糖溶液中，避光反应12 h。收集反应液置入8 K～14 K透析袋对大量去离子水透析48 h，最终冷冻干燥得到橙黄色FITC标记的两亲性壳聚糖。 　　1.3.1.4荧光纳米粒悬液的制备 取一定质量的FITC标记两亲性壳聚糖，溶解于超纯水，在冰浴中用探头是超声分散20次，工作6s/次，间隔4s，超声功率80 W。最后用0.8 μm水系滤膜过滤，-20℃下避光保存。 　　1.3.1.5荧光标记胰岛素的制备 称取猪胰岛素200 mg分散于45 ml超纯水，加入NaHCO3和Na2CO3粉末得0.25 M碳酸盐缓冲体系，最终pH=9.5。精确称取5.0 mg FITC溶解于5 ml甲醇后在搅拌下逐滴缓慢加入胰岛素溶液中，搅拌混合均匀后，置于4℃下避光反应12 h。反应结束后，称取2 mg甘氨酸用少量去离子水溶解后滴入反应液以终止反应。以体积排阻色谱法除去未反应的FITC、缓冲盐、甘氨酸和少量杂质与副产物（葡聚糖凝胶柱Ф15 mm*200 mm，固定相为sephadex G25），收集最先流出的黄色条带组分，合并后冷冻干燥，得到纯净的橙色FITC标记胰岛素粉末。 　　1.3.1.6荧光标记胰岛素的装载 装载方法与同1.3.1.4类似，只是在开始时加入INS与两亲壳聚糖纳米粒混合。