小分子干扰RNAsiRNA对斑马鱼血管生成的影响.pdf

福建凌n 第三届海洋生物高技术抡坛 2005．08．19．23 小分子干扰RNA(siRNA)对斑马鱼血管生成的影响 杨少丽‘ 阎松牛荣丽林秀坤木 (中国科学院海洋研究所，青岛，266071) endothelialfactor,VEGF)基因设计了特异性小分 斑马鱼血管内皮生长因子(vascular growth RNA，siRNA)，构建了siRNA稳定表达载体，并从血管生成、 子干扰RNA(smallinterfering mRNA以及蛋白水平研究了siRNA对VEGF基因表达的影响。结果显示，我们成功地构建 了siRNA表达载体，lng表达载体通过显微注射转染斑马鱼受精卵后可以显著抑制斑马鱼胚 胎血管的生成，同时，VEGF基因mRNA和蛋白的表达量明显降低。研究结果表明所设计 siRNA可以有效地沉默VEGF基因，我们的研究表明斑马鱼可作为一种简便、有效的模型， 用于以血管生成为靶点的抗肿瘤药物研究。 关键词：siRNA，斑马鱼，血管生成，VEGF基因 斑马鱼属鲤科短担尼鱼属，成鱼体长3-4cm，孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔 几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。斑马鱼由 J：个体小，养殖花费少，能大规模繁育，是最受重视的脊椎动物发育生物学模式生物之一。 斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活 性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，近年来作为一种模式生物被广 泛用于胚胎的分子发育机制、疾病模型的构建以及新的药物筛选等研究中。 stranded 双链RNA(double 的现象被称为RNA干扰(RNA 物(包括线虫、果蝇和哺乳动物)中，由+j。苦能够特异性地缄默靶基因的表达，是一种研究 基因功能的有力T具。然而在大多数哺乳动物细胞中，转染长于30个核苷酸的dsRNA会激 活抗病毒的干扰途径引起非特异性的基因表达抑制。在模式生物斑马鱼中，也发现注射长于 et o而应用21．nt小分子干扰RNA， al，2000)Ill 30bp的dsRNA会引发非特异的基因沉默(Oates 能够特异性沉默靶基恻而不会引起干扰素应答，在基凶功能研究、信号传导通路、基因治疗 等方面得到了日益广泛的应用。 血管生成为肿瘤生长、转移所必需，近匀i来血管生成已成为抗肿瘤药物的重要靶点。血 管内皮生长凶子(VEGF)在肿瘤的生长过程中具有极其重要的作用，细胞水平的研究表明， 抑制内皮绌胞中VEGF的表达可有效抑制肿瘤内皮细胞的血．管生成过程。我们实验室正在构 建斑马鱼作为抗肿瘤药物I，|勺研究模型，试图发现新的以血管生成为靶点的抗肿瘤海洋药物。 $通讯作者。E．mail：linxiukun@yahoo．com 724 覆建凌n 第三届海洋生物育技术论坛 2005．08．19-23 siRNA稳定表达载体，成功地干扰了VEGF基因的表达。我们的研究表明，以VEGF为靶点 的siRNA可有效抑制斑马鱼胚胎中VEGF的表达，并能抑制胚胎发育过程中的新生血管生成。 l材料和方法 1．1实验材料 实验用斑马鱼为本实验室饲养，设计的siRNA由上海生物技术有限公司合成，pSilencer 4．1一CMVneo 生物等生物公司产品。 1．2实验方法 1．2．1siRNA设计 从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA”。二连序列，并记下其3’端的19个碱 作为优选的序列。将选定的)-YN币nN应的基因组数据库(人或者小鼠、大鼠等)进行比较， 排除那些和其它编码序列／EST同源的序列。为了便于克隆和鉴定，siRNA的5’端和3’端分 别引入BamHI和Hind口酶切位点形成BamH 设计的siRNA序列如下(选择VEGFl087—1105位点为siRNA的结合位点)。 1．2．2 siRNA表达载体的构建与鉴定 siRNA表达载体|，I勺构建按照Amb