小分子毛细管电泳免疫分析方法研究.pdf

A06小分子毛细管电泳．免疫分析方法研究 张新祥 北京分子科学国家实验室(筹)北京大学化学学院，北京100871 一．毛细管电泳免疫分析的发展 Ab)之问高 免疫分析(immunoassayIA)是建立在抗原(AntigenAg)和相应(Antibody 特异性的免疫结合反廊的基础上，利用抗体(或抗原)作为选择性试剂测定抗原、半抗原(或 抗体)的方法。免疫分析的主要特点是高选择性和高灵敏度。近几年来，CE与n的联用由 于其独特的优势越来越受到人们的关注，这不仪为免疫分析拓宽了道路，也为毛细管电泳的 发展注入了新的活力。 免疫分析与毛细管电泳技术的联用包含两个方面，一种是毛细管电泳免疫分析(Capillary CEIA)。从原理上讲，CEIA是利用抗原抗体复合物与游离的抗原、 electrophoreficimmunoassays 就利用CE对抗原、抗体和半抗原进行了分离。除了快速、灵敏等特点，CEIA与传统电泳相 比具有很大优势。另一方面，CEIA也面临许多新的挑战：如生物样品对毛细管壁的吸附需要 克服，一些重要的免疫分析需要酶放大等技术的应用等。根据分析对象的不同，CEIA可采用 竞争性免疫分析和非竞争性免疫分析两种模式。CE有多种分离模式，已经与免疫分析联用的 作用。 另一种是免疫分离一毛绌管电泳，这种模式中，主要是利用免疫反应从复杂生物基体中 选择性提取和富集待分析的小分子，再进行毛细管电泳分析分离的技术，目前已经发展出了 离线和在线等分析模式。特别是多标的抗体的制备和应用，使得该方法可以同时应用于多种 类似化合物分析，在研究药物代谢等方面将可能有很好的应用。 二．毛细管电泳免疫分析方法的应用 1．毛细管区带电泳结合激光诱导荧光检测的免疫分析方法 实验中我们以异硫氰基荧光素标记全抗原，结合毛细管电泳和激光诱导荧光检测，采用竞 争免疫分析模式，利用游离样品于标记抗原竞争有限量的多抗及单抗，从而测定样品含量。 我们用此法研究了兴奋剂甲基睾酮和吗啡以及血清中的雌激素取得了令人满意的效果。 2．水凝胶毛细管电泳免疫分析 目前毛细管电泳免疫分析的主要分析模式是在线和离线的区带电泳模式。但当其用于检 测生物基质，特别是蛋白质时，生物基质对管壁的吸附使分析的准确性受到了很大的影响。 这是因为，大分子物质蛋白吸附到毛细管壁上，改变了柱壁的组成和荷电情况，因而影响了 分析测定的分离度和重现性。目前解决的方法主要有两个，一是对管壁进行烷基化或聚丙烯 酰胺涂层修饰。但其修饰效率不高。—堤使缓冲溶液pH值处在极端情况下(pH3或pH10) 会抑制吸附，但又会影响抗原抗体的构象，可能导致活性的变化，限制了临床的应用。 温度敏感水凝胶是一种自身能感知外界的温度变化，并能产生相麻的物理(结构)及化 学变化甚至突变的一类高分子凝胶，是环境敏感性凝胶的一种。我们建立了以温敏胶为分离 介质的毛细管电泳免疫分析力法，并对甲基睾酮、吗啡两种禁用品进行了分析。实验中，我 们检测了血样中未经代谢的甲基睾酮，抗原抗体结合率达60％，远远高于CZE模式(20％)。 对吗啡的检测中，抗原抗体复合物和标记游离抗原在30s内即得到分离，免疫反应结合率达 80％，检测限达8．58ng／mL。我们还分别建立了毛细管电泳免疫分析血清中雌酮、雌二醇和雌 三醇的方法。实验结果表明，所建立的CEIA方法的灵敏度和准确度可以满足雌激素样品常规 诊断与临床检测要求。我们认为，PNIPA的亲水．疏水变化及其屏蔽作用，有效地抑制了蛋白 质对管壁的吸附；同时，凝胶的尺寸排阻效应利于待测样品的有效分离。而将抗体与水凝胶 偶联，与缓冲溶液～起冲入毛细管中作为电泳介质，抗体能均匀地分布于毛细管内，并与进 入毛细管的抗原和待测物反应，反应迅速，缩短达到平衡的时间，分析过程加快。同时抗体 偶联到水凝胶上，很容易被冲出毛细管，结合的抗原等同时带出，减小了吸附，同时毛细管 可以反复使用。将特异性抗体偶联于温敏水凝胶上作为快速检测的手段是非常具有实用价值 的，其在药物及临床检测方面的应用是令人注目的。 3．二抗体系水凝胶．毛细管电泳免疫分析 为了进一步提高分析测定的灵敏度，我们引入了探针系统。标记二抗体系是一个合适的 选择，它便宜、易得、易商品化，是通用探针的理想选择之一。二抗可以与一抗多价结合， 具有一