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微流控芯片单细胞进样和溶膜 高健夏方泉殷学锋+金文睿方肇伦 (浙江大学化学系微分析系统研究所3 10028杭州) 单细胞分析是目前分析化学学科的前沿研究领域之一，一般包括细胞衍生、单细胞 导入、细胞溶膜、胞内组分分离检测等几个步骤。由于细胞极小，组分复杂，开展单细 胞水平的分析难度很大。20世纪80年代发展起来的毛细管电泳(CE)分离方法具有样 品量少，分离度高等优点，适用于多种组分测定和定量，90年代用于单细胞多组分的定 量检测，取得一定成果11州。早期毛细管电泳采用脱线溶膜，因稀释使检测灵敏度较低， 后采用在线溶膜，但因毛细管电泳的一维结构，使单细胞进样和溶膜操作复杂，分析速 度较慢。 微流控芯片因其具有网络式通道，体积小、可操控性强、管道细、稀释倍数小等优 点，特别适合单细胞的操纵垆’6J及胞内组分的分离检测。本文研究了如何在微流控芯片上 利用液压和和夹流技术进行单个细胞自动进样和溶膜。 取1此全血于lmL离心管中，用生理盐水(0．7％NaCl水溶液)稀至1mL，离心5 min(1000rpm)，弃上清液。加入生理盐水，轻轻振荡混匀，再离心。重复上述步骤3～5 次，至上清液澄清透明后，加入生理盐水lmL，混匀得lmL红细胞悬液，密度约为240 cell／ml。 用标准光刻和湿法刻蚀技术制备的双-T通道 微流控芯片如图1，其中，S．SW为进样通道， B．BW为分离通道。 电泳缓冲液为硼砂．NaOH缓冲体系， pH=9．48，其中加入十二烷基磺酸钠(SDS， 0．1wt％)作为溶膜剂。 DoubleTCross Schematic．Dimensions Figure．I Chip 用CCD通过倒置显微镜摄录的单细胞导入are in devices millimeters．Channelwidthsarefor given etchedtoa center-to-centerdistancebetween 和溶膜过程示于图2。将红细胞悬液加入S 25-1nm．The the ofthedouble·T isO2mm． arms injector 处的样品池，将电泳缓冲液加入B池，调节 液面高度，使HsH企HB、vHsw，则无需加电，细胞成单行由S沿进样通道顺序流向SW， 图2a。 b)，在B和BW之间施力H+1400V的分离电 当某单个细胞(a)通过双T之间的区域(图2 压，同时在S和Sw二处分别施加电压800V，在电渗流和夹流作用下，单细胞流沿分离 通道流向BW，实现了单细胞的导入(图2c)。当分离通道施加场强为280V／em，细胞流 速为O．5mm／s。实验中观察到，上述过程细胞溶膜时间较长(约1—2s)，主要原因是，电泳 缓冲液中含有的化学溶膜剂SDS必须与存储单细胞的生理盐水相互混合后才能发挥溶膜 作用，而这一混合过程在微流控芯片中需要较长时间。从而导致了分离通道有效长度缩 短约1．0cm。 通过在分离通道上施加一个较小场强(30V／cm)，同时在S和SW二处分别施加电压70V， 可使通过双T之间的区域细胞b贴在管壁上(图3a)，其他细胞也停止流动。然后迅速 加大电压至图2c所示的电压值，在电渗流的作用下缓冲液流经静止的贴壁细胞而充分接 触，用CCD监视，细胞b不断在原地缩小，并在40ms内消失，(图3b)，说明溶膜时间 小于40 ms。胞内组分随即被电泳分离。用激光荧光共聚焦分析仪(激发波长488nm，荧 光波长518nm)测得的F1TC标记的单细胞电泳图示于图4。