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(一)制备MS固体培养基 MS培养基包括20多种营养成分,实验室一般使用4℃保存配制好的培养基母液来制备 1、配制各种母液 ①无机物中大量元素浓缩10倍,微量元素浓缩100倍,常温保存 ②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液 ③用母液配制培养基时,需要根据各种母液的浓缩倍数,计算用量 2、配制培养基 分装到锥形瓶中,每瓶分装50ml或100ml ① 配制培养液 ② 调PH ③ 培养基的分装 由于菊花的茎段的组织培养比较容易,因此不必添加植物激素 3、灭菌 分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌 1、选材:菊花茎段,取生长旺盛的嫩枝 (二)外植体消毒 2、消毒 ①流水冲洗 菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉,用软刷轻轻刷洗,刷洗后在流水下冲洗20min左右 ② 酒精处理 用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分,放入体积分数为70%的酒精中摇动2-3次,持续6-7s,立即将外植体取出,在无菌水中清洗 ③消毒液处理 取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分,放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中1-2min,取出后在无菌水中至少清洗3次,漂净消毒液 (三)接种 污染的主要来源是空气中的细菌和孢子,接种室消毒是至关重要的。用70%的酒精喷雾使空气消毒, 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟。 1、接种室消毒 2、无菌操作要求 操作要在酒精灯火焰旁完成,每次使用器械后,都需要用火焰灼烧灭菌,接种后立即盖好瓶盖。 3、材料的切取和接种 将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成0.5~1cm的小段,用镊子夹取菊花茎段接种。 4、接种注意事项 ①每接种一块外植体前,镊子需放入体积分数为70%的酒精溶液中消毒一次,然后在酒精灯火焰上烧一遍,冷却后再接种 ②外植体在培养基中要分布均匀,放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定,一般胡萝卜3-4块,菊的茎或叶6-8块,也不要太少,以充分利用培养基中的营养成分和光照条件 ③插入时应注意方向,形态学上端朝上,形态学下端朝下,不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分 正常苗 污染苗 1、外植体带菌 2、培养基及接种器具灭菌不彻底 3、接种操作时带入 4、环境不清洁 污染途径 思考:你打算做几组重复?你打算设置对照实验吗? 答:每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶,与接种操作后的锥形瓶一同培养,用以说明培养基制作合格,没有被杂菌污染。 (四)培养 接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养,培养期间应定期消毒 培养温度控制在18-22℃ 每日用日光灯光照12h (五)移栽 移栽生根的菊花试管苗之前,应先打开培养瓶的封口膜,让试管苗在培养间生长几日。一般放置在20~25℃的遮荫环境中,适应5~7d。试管苗不萎蔫,有新生长的趋势,便可移栽。 1、打开封口膜 2、清洗转移 用流水清洗根部的培养基,将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间 3、移栽 幼苗长壮后,移栽到土壤中 固体基质型,含水量高、 蓄水性强、透性好,适合栽培 珍珠岩 ,珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩,经急剧冷却而成的玻璃质岩石,有弧形或圆形裂隙,如珍珠的结构,所以被命名为珍珠岩 。 蛭石是一种天然、无毒的矿物质,在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物,属于硅酸盐。 (六)栽培 幼苗移栽后,每天观察并记录幼苗的生长情况,适时浇水、施肥,直至开花 1、培养基的灭菌(高压蒸汽灭菌) 2、外植体的消毒(酒精、氯化汞) 3、接种的无菌操作(酒精、酒精灯——灼烧) 4、无菌箱中的培养; 5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。 在整个操作过程中,是如何来实现无菌环境的? 结果分析与评价 (一)对接种操作中污染情况的分析 (二)是否完成了对植物组织的脱分化和再分化 (三)是否进行了统计、对照与记录 (四)生根苗的移栽是否合格 五、课题延伸 1、一般来说,容易进行无性繁殖的植物,也容易进行组织培养 2、实例:芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季 营养繁殖 扦插 嫁接 压条 扦插 嫁接 压条 练习 1.答:植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差,对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长,如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染,就会导致实验前功尽弃,因此要进行严格的无菌操作。 2.答:外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好,容易诱导脱分化和再分化。 菊花的组织培养 再分化 材料性质、营养物质、 调节物质、环境条件 外植体的消毒 接种 基本原理: 细胞的全能性 基本过程: 脱分化 愈伤组织 影响因素: 操
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