橡胶树茉莉酸生物合成关键酶AOS基因启动子的克隆及序列分析.pdfVIP

橡胶树茉莉酸生物合成关键酶AOS基因 启动子的克隆及序列分析 段翠芳1曾日中黎瑜魏小弟 ，中国热带农业科学院橡胶研究所农业部 ＼ L热带作物栽培生。理学重点开放实验室 海南儋州 571737) 子，获得的启动子片段的大小为1652bp。序列分析表明：AOS基因启动子序列除了具有TATAbox和CAATbox 以外，还具有多种与伤害、胁迫及激素刺激有关的特殊的序列元件。 brasiliensis) acid) 关键词橡胶树(Hevea 茉莉酸(JasmonicAOS启动子 植物在干旱、高盐、低温等逆境条件下发生一系列生理生化及发育方面的应答反应来减少逆境对其细 胞的损伤，并且某些基因表达也将产生相应的变化u’1…。启动子是结构基因5’端上游与RNA聚合酶及一些 反式作用因子结合的区域，是供RNA聚合酶识别、结合…，并确保转录精确而有效地起始的一段DNA序列， 其结构直接关系到转录的效率旧1。因此启动子中会含有一些决定基因表达频率和特异性的元件。按照各种 基因表达特性的不同，启动子分为组成型、诱导型及特异性启动子。过去，在转基因植物研究中，一个组 成型高效强启动子花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子应用较广。但是35s启动子调控其下游基因的组成 型在某些情况下高表达， 使得转基因植株的生长受到阻碍。近来， 诱导型启动子开始应用于拟南芥、烟 草和水稻等植物中旧一…。外源茉莉酸和伤害可以诱导橡胶树的乳管分化，这一发现对橡胶树的产胶有着重 要的意义…1。橡胶树茉莉酸生物合成关键酶AOS对是茉莉酸的生物合成的限速和关键步骤。它的表达对调 控橡胶树茉莉酸的生物合成有重要作用。本研究根据本课题组已获得的橡胶树茉莉酸生物合成关键酶AOS 基因的eDNA序列，克隆了橡胶树茉莉酸生物合成关键酶AOS基因启动子片段，为进一步研究其功能，并 为用该基因的启动子调控橡胶树茉莉酸的生物合成，以提高茉莉酸诱导的橡胶树乳管分化相关基因的表达 奠定基础。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1 试验材料 巴西橡胶树(Heyea 质圃提供，幼叶采集后用于DNA的提取。 1．1．2 酶和试剂 GenomewalkerTMkit购自BD CLONTECH公司；T4DNA连接酶及pGEM-T-Easy Wl， Extraction (Madison， USA)；DNA凝胶回收试剂盒(Gelkit)为QIAGEN(USA)公司产品。 1．2试验方法 1．2．1构建Genomewalker文库 1．2．1．1 N N TA 基因组D A的提取橡胶树基因组DA的提取采用了改良的c B法。 I、EcoRV、Stu 1．2．1．2橡胶树基因组DNA的酶切用4个1．5ml的离心管，用DraI、PvuV四种酶 分别对橡胶树基因组DNA进行酶切。 1．2．1．3酶切后DNA的纯化及与Genomewalker kit说明书 进行。 1．2．2GenomewalkerDNA Walking 1．2．2．1引物的设计根据本课题组已克隆的橡胶树茉莉酸生物合成关键酶AOS基因cDNA序列设计合成 GSPl：5’ 进行第一轮PCR(GSPI)和第二轮PCR(GSP2)的两个特异引物： 1国家自然科学基金资助研究项目，项H编号- 段翠芳，女，1977年生，助研，现主要从事植物分子生物学研究．电话：0898 230 DNA 1．2．2．2从Genomewalker文库中进