蛋白质的表达2选编.ppt

Expression of protein 人工合成尿素 自然界的矿物等无机物千年万年，亘古不变，是没有生命的；而有机物不同，是有生命的。 无机物----有机物（生命） 动植物体内存在着一种生命力，只有依靠这种生命力，才能产生出有机化合物，即有机物只能在有生命生物体内产生。 化学家在实验室只能将有机物转化为新的有机物，而不能用无机物制造出有机物。 蛋白质的生物合成 胰岛素—有生物活性的蛋白质 Ⅰ. Expression system In vitro ： in vitro protein synthesis system Prokaryotic Expression System - E. coli, B. subtilis In vivo yeast Eukaryotic Expression System insect cells mammalian cells Ⅱ. Prokaryotic Expression System ?? Escherichia. coli, because of the wealth of knowledge regarding its biochemistry and genetics can be considered a good first choice for the preparation of proteins. ?? However, E. coli might not yield protein suitable for analysis, then other systems must be examined?? 1.基因表达在原核生物与真核生物中的差别？ 原核生物表达系统和真核生物表达系统具有各自的特点。 在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时， mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。 在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。 2.真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法 将真核基因克隆到1个强大的原核promotor和SDs的下游,使真核基因处于原核启动子的控制之下,转录物由于原核SDs能与核糖体rRNA结合,可在原核表达.这是克服1,2困难的好办法. 从真核分离出mRNA并逆转录成cDNA,cDNA有完整的编码顺序,但无内含子 是采用伪装办法→将真核基因插到原核基因某密码之后,其翻译产物N端有原核多肽,这样表达的融合蛋白,可躲避细菌蛋白酶降解作用. 3.大肠杆菌表达载体的组件 复制起始点 origin of replication 选择性基因 selection marker 多克隆位点 MCS 启动子 promoter 终止子 terminator 核糖体结合位点 ribosome binding site Prokaryotic Expression System 复制起始点 保证载体可以正确复制和增殖 pBR322和pUC的复制起点，它们皆来源于ColE1质粒 质粒具有不相容性 通常表达载体都会选用高拷贝的复制子 选择性基因 至少有一个选择性基因，可用于转化体的确定，并可在培养过程中保持质粒的稳定性。 LB倒板前加抗生素的温度 超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢 多克隆位点 具有单一酶切位点的多克隆位点，便于外源基因的插入 3.1启动子 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 -10区（pribnow box）和 -35区组成 分类 转录形式 组成型 诱导型 强弱 取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。 3.2 The Terminator ?? Stops RNA synthesis at specific points along the DNA template ?? The enzyme stops polymerising nucleotides in