生化毒理学讲解.pptx

食品添加剂亚硫酸钠对肝细胞蛋白合成功能的影响 主讲人：余艳萍 时间：2015年11月9 毒理学杂志 2010 年 12 月第 24 卷第 6 期 J Toxicol December 2010 Vol. 24 No. 6 背景介绍 材料与方法 结果 讨论 食品添加剂亚硫酸钠对肝细胞蛋白合成功能的影响 毒理学杂志 2010 年 12 月第 24 卷第 6 期 J Toxicol December 2010 Vol. 24 No. 6 定义：食品添加剂是指为改善食品品质和色、香、味以及为防腐和加工工艺的需要而加入食品中的化学合成物或天然物质。食品添加剂一般可以不是食物，也不一定有营养价值，但必须符合上述定义的概念，既不影响食品的营养价值，又具有防止食品腐败变质、增强食品感官性状或提高食品质量的作用，且必须是一定剂量内对人体无害的。 分类：我国的《食品添加剂使用卫生标准》将其分为22类：防腐剂；抗氧化剂；发色剂；漂白剂；酸味剂；凝固剂；疏松剂；增稠剂；消泡剂；甜味剂；着色剂；乳化剂；品质改良剂；抗结剂；增味剂；酶制剂；被膜剂；发泡剂；保鲜剂；香料；营养强化剂；其他添加剂。?? 各种食品添加剂及制成品 亚硫酸盐是一类方便食品中常用的添加剂，是一种还原性漂白剂，对食品有漂白作用和对植物性食品内的氧化酶有强烈的抑制作用。我国规定可用于蜜饯，也可用于竹笋、蘑菇、各种糖类、水果（如葡萄、黑加仑）浓缩汁，有时还用到一些新鲜海制品的保鲜过程中，同时还是很多种药物的常用还原剂。在当今快节奏的生活情况下，人们对于方便食品的需求会逐渐增加，这就使人们长期暴露于亚硫酸盐环境无法避免。 背景介绍—亚硫酸盐 背景介绍—亚硫酸钠对肝细胞的损伤作用 临床观察发现含亚硫酸盐水平高的氨基酸输注液可引起患者血清中转氨酶活性增强，严重的还引起肝细胞坏死；一些流行病学调查发现亚硫酸盐纸浆生产企业工人的肝癌的发病率增加，Lovati等在动物实验中也发现二氧化硫吸入可引起大鼠高脂血症和肝细胞中甘油三酯(TG)含量明显增加，他认为肝细胞中甘油三酯的增多主要是通过影响载脂蛋白的合成，限制TG进一步包装分泌，从而引起肝细胞中TG的堆积，导致肝功能受损。 前人的研究发现，二氧化硫接触之后的肝脏超微结构发生明显改变，出现肝细胞水肿变性、脂肪变性、粗面内质网明显扩张、嗜酸性变，甚至肝细胞的坏死等，尤其是肝细胞中出现大量大小不等的脂滴(主要成分为甘油三酯)，而二氧化硫的这种肝细胞的损伤作用被认为是与亚硫酸盐水平显著增加密切相关的? 材料与方法 一.材料 正常人二倍体肝细胞(HL-7702 ) 购自中科院细胞库，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、白蛋白测定试剂盒、AST 测定试剂盒、ALT 测定试剂盒;胰蛋白酶;DME/F12 干粉培养基;胎牛血清。 二.方法 1.细胞培养： 将HL-7702 肝细胞培养于DME /F12 培养液，37 ℃ 下置5% CO2培养箱中培养;2 ～ 3 d 更换一次新鲜培养液，6 ～ 7 d 按1/3传代一次。 2.亚硫酸钠染毒：参照相关文献和前期试验结果，选取亚硫酸钠染毒浓度分别为0.039，0.125，0.625 和2.5 mmol/L，设一个磷酸盐缓冲液(PBS) 阴性对照组和0.3% 乙醇阳性对照组。亚硫酸盐先配成100 mmol /L 原液保存，使用时稀释成应用液。选对数生长期的细胞用于实验，先用胰蛋白酶溶液消化，制成单细胞悬液，计数，调细胞浓度为5×104 个/ml，将细胞悬液接种于12 孔培养板，每孔加1.8 ml，置37 ℃、5% CO2孵箱过夜，待细胞贴壁后进行染毒。 2.亚硫酸钠染毒 染毒后将12 孔细胞培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱培养，分别于24、48 和72 h 后吸取细胞培养上清液进行各生化指标的测定。 3.肝细胞培养上清中AST、ALT、白蛋白和总蛋白含量的测定: 按试剂盒说明，采用赖氏比色法测定上清中AST 和ALT，在制备好的样品中分别加入AST、ALT 试剂盒中相对应的试剂后，混匀，室温放置5 ～ 10min，505 nm 波长，蒸馏水调零，测定各管吸光度A 值。 则绝对A 值=测定管A值—对照组A 值，查试剂盒内标准曲线，求得相应的ALT、AST 活力单位(1 卡门氏单位= 0. 482 IU /L，25 ℃)。 白蛋白的测定采用溴甲酚绿比色法。在628 nm处，空白管调零，测各管A 值。根据以下公式计算白蛋白含量: 蛋白含量( g /L) =( 测定管吸光度/ 标准管吸光度)× 白蛋白标准品浓度(g /L)。 总蛋白的测定采用考马斯亮兰法。在595 nm 处，蒸馏水调零，测各管A 值。根据以下公式计算总蛋白含量:蛋白含量( g /L) = ［( 测定管A 值－ 空白管A值) / ( 标准管A 值