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分子医学技能-实验三 琼脂糖凝胶电泳法 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 原理： 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm~365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。 琼脂糖电泳分离DNA的范围 琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 电泳指示剂 核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）呈蓝紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 胶浓（%） 溴酚蓝 二甲苯青 0.6 1kb 1 0.6kb 2kb 1.4 0.2kb 1.6kb 2 0.15kb 影响凝胶电泳的因素 DNA的分子大小、构象 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比。 超螺旋DNA移动最快,开环其次、线状双链DNA移动最慢。 琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。 影响凝胶电泳的因素 电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 实验材料及试剂 琼脂糖 电泳缓冲液：1?TAE 6 ?加样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油 EB染色液； 溴化乙锭 实验操作及注意事项 琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、1%倒胶3mm、凝固后拔梳） 倒缓冲液，加样（样品中加入1/5体积的上样buffer） 电泳（方向、电压、时间） 染色与检测（EB10 min，紫外检测） 注意事项 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使制板变形 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多 EB有毒（现在用低毒的染料，好一点），切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔 紫外线照射不要太久