Co-Immunoprecipitation免疫共沉淀讲义.ppt

Co-Immunoprecipitation 1、原理 2、操作 3、优点 4、局限性 5、应用 1、原理 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation) 是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。 是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。 这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 2、操作 （1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 最大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min； （4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连； （5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟； （6）SDS、 Western blotting或质谱仪分析。 3、优点 （1）与蛋白质亲和层析一样, 检测的产物是蛋白质的粗 提物； （2）抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的浓度存在，避免了人为效应所造成的过量表达； （3）蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在； （4）复合物以天然状态存在，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免人为影响, 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。 4、局限性 （1）需要多克隆抗体或mAb，因而对大规模筛选未知蛋白会遇到障碍； （2）免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物为直接相互作用的两种蛋白； （3）用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合适，与 Western blotting或者ELISA相比容易出现假阳性反应； （4）灵敏度不如亲和色谱高。 5、应用 主要应用于肿瘤异质性研究、信号通路分子的研究、染色质免疫共沉淀(ChIP)技术 由于蛋白质间相互作用具有重大的意义，因此其检测方法的研究也备受重视。蛋白质相互关系的研究以后会愈演愈烈，我们不仅仅可以通过免疫共沉淀技术来证实，还有越来越多的先进技术值得我们去运用和发展。