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HPLC仪及其使用P245 一、流程 process of HPLC HPLC仪器结构示意图 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 工作过程： 一.流程 （一）输液系统 1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。 二.主要部件 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性 2 高压输液泵 梯度淋洗装置 外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 泵的操作注意问题 1、防止固体微粒进入泵体 2、流动相不含腐蚀性物质 缓冲液防盐析出 3、防空泵运转 4、使用压力不超标 5、流动相应先脱气 故障排除 1、无流动相流出，又无压力指标 应排气或换密封环 2、压力和流量不稳 排气泡或清洗相关部件 3、压力过高或过低 过高：管路堵塞；清洗 过低：管路泄漏 流动相的脱气和贮存 1、流动相中的空气的影响： 输液系统、色谱柱的分离效率、检测器的灵敏度 基线的稳定性 可能与样品、固定相或流动反应。O2在260nm以下有吸收，有荧光熄灭作用，影响电化学检测。 2、脱气方法 超声脱气 通氦脱气 抽真空脱气 加热脱气 在线脱气 梯度洗脱注意问题 1、溶剂互溶 2、纯度高 3、注意混合溶剂粘度的变化 4、柱的再生处理  (二）色谱柱系统进样器+色谱柱(1) 进样装置 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示： 进样阀 样品 装样 废液 淋洗液 至分离柱 六通阀进样 （ＬＯＡＤ） （ＩＮＪＥＣＴ） 样品环 (2)色谱柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 不锈钢管制成，内壁高度光洁 常规分析型 Φ2-5mm 长 10-30cm 窄径柱 Φ1-2mm 长 10-20cm 毛细管柱 Φ0.2-0.5mm 长10-20cm 制备型 Φ20-40mm 长10-30cm 固定相采用匀浆法高压装柱 1． 柱效评价 2005版《中国药典》规定，需进行“色谱条件与系统实用性实验”给出分析状态下色谱柱（应达到的）最小n理 R 主要依据大连依利特公司的评价条件 硅胶柱： 样品：四氯化碳(K=0)苯，萘，联苯，菲（用正已烷配制） 流动相：正已烷 反向色谱柱（ODS柱等）： 样品：苯磺酸钠或尿嘧啶（K=0），苯，萘，联苯，菲 流动相：甲醇-水 （83：17） 乙腈-水 （60：40） 正相色谱柱（氰基与氨基柱） 样品：四氯乙烯（K=0） 邻苯二甲酸二甲酯 邻苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇 （偶氮带，氧化偶氮苯及硝基苯） 流动相：正庚烷 见书：P253表4-15 柱效指标J 粒径 n理 （万/米） 3微米 8万 4…… 6万 5…… 5万 7…… 4万 10…… 2万 2、色谱柱的使用和维护 良好的色谱实验习惯