免疫组织化学的基本理论与技术3分解.ppt

第二章 免疫组织化学的基本理论与技术 一、免疫组织化学的基本理论 原理： 免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC) 是利 用抗原与抗体特异性结合的原理，使用荧光素、酶、金 属离子、同位素等标记抗体以确定组织细胞内抗原(多肽 和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 此法可在光、电镜水平观察细胞膜及胞内某种抗原 物质的存在，从而为研究生命大分子，特别是酶、蛋白 质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及 代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的 原位分析细胞组成物质的手段。 二、抗原与抗体 1.抗原 (antigen,Ag) 定义：是指能刺激机体产生免疫应答，并与相应的免疫产物（抗体）发生特异性结合的物质。 蛋白质：免疫原性最强； 多糖：免疫原性次之； 脂类和核酸：必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。 2.抗体 (Antibody, Ab) 定义：是机体受到抗原刺激后，由免疫细胞合成并分泌出 一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白。 存在部位：主要存在于血清内。 分类：根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种， 即IgG、 IgD、IgE、IgA、IgM。 根据制备方法不同分为两种:单克隆和多克隆 IgG的结构 IgG分子呈“Y”型由两条L链和两条H链组成。用木瓜酶水解IgG可得到3个片段：两个相同Fab段或抗原结合段和另一Fc段或可结晶段。在Fab段与Fc段之间有一个对酶敏感的区域，称铰链区。 多克隆抗体 制备原理： 将纯化的抗原注射入动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。 单克隆抗体 Ag 合成抗体 效应性B 细胞 (浆细胞) 不能在体外生长 瑞士Kohler 英国Milstein 多发性骨 髓瘤细胞 多发性骨 髓瘤细胞 不能合成抗体 能在体外大量繁殖 脾 多发性骨 髓瘤细胞 Ab Ab Ab Ab Ab Ab Ab Ab Ab Ab Ab Ab Ab Ab Ab Ab 抗体 单克隆抗体 多克隆抗体 缺点:价格较高，容易出现假阴性反应。 实质:是受同一种抗原刺激，由多个B淋 巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 优点:容易制备，价格便宜。 缺点:可能与多种特异性和非特异性的抗原决定簇反应，出现非特异性染色，影响结果的判定。 实质:是受同一种抗原刺激，由单个B淋 巴细胞克隆所分泌的抗体。 优点:特异性强，敏感性高，抗体产量高。 首选 三、免疫组织化学的基本技术 免疫组织化学技术是用标记物标记的抗 原(或抗体)检测组织和细胞内的抗体(或抗 原)，从而达到诊断或研究的目的。 三、免疫组织化学的基本技术 特定抗原(或抗体)的显示和定位是否准 确与细胞和组织标本制备质量好坏密切相关。 因此，组织和细胞标本的取材和制备至关重 要。 （一）标本制备 1.组织标本制备： 石蜡标本 冰冻标本 振动标本 塑料包埋切片标本 2.细胞标本制备： 印片法 穿刺吸取涂片法 体液沉淀涂片法 体外培养细胞 离心涂片机法 石蜡标本制备 取材 石蜡标本制备 取材 （1）取材时间：迅速，一般在2h以内进行。 （2）取材刀：锋利，避免来回拖。 （3）组织块大小：厚薄要均匀，厚度＜0.2cm，大小1.5X2.0 cm2为宜。较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、 大块癌组织等可适当厚一点，而脂肪组织、肺组织、纤维性 肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应略取薄一 些。 石蜡标本制备 取材 （4）取材部位：取含待检抗原部位，还应取病灶与正常交界 处，即抗原阳性和阴性区，必要时取远离病变区的正常组织 作为对照。对于只研究正常组织抗原，取材时应尽可能避开 坏死区。 （5）淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围脂肪组织。 （6） 如组织内有缝线、钉书针或骨组织，必须除去或避开， 如碰到不可避免的骨组织或钙化组织，应与技术室讲明，进 行脱钙处理。 石蜡标本制备 取材 （7）纤维组织、肌肉组织取材时，注意纤维或肌肉走向，尽 可能选择与纤维或肌肉的走向平行、并以此为长轴切取。 石蜡标本制备 固定 （1）定义：组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量 接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。 （2）目的：防止组织细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋 白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水