基于同步扫描相机的荧光寿命测量系统研究.pdfVIP

第 26 卷第 4 期 2009 年 10 月 深圳大学学报理工版 Vol. 26 No.4 Oct.2009 JOURNAL OF SHENZHEN UNIVERSITY SCIENCE AND ENGINEERING 文章编号: 1000-2618 (2009) 04-0331-06 [生物医学工程] 基于同步扫描相机的荧光寿命测量系统研究 邵永红1 ，李恒1 ，2 ，王岩1 ，屈军乐 1 ，牛憨笨l (1.深圳大学光电工程学院，光电子器件与系统教育部重点实验室，广东省光电子器件与系统重点实验室，深圳 518060; 2. 西安工业大学光电工程学院，西安 710032) 摘 要:建立一台基于同步扫描相机的双光子激发荧光寿命显微测量系统，同步扫描相机的重复工作 频率为 76 MHz，利用铁宝石飞秒激光器作为光源，通过可调延时器和标准具对扫描相机的时间分辨率、扫 描速度以及非线性等进行标定.该系统的时间分辨率为 9 ps，非线性小于 4% ，量程为 2.8 ns. 测量了荧光 染料 Rose Bengal (RsB) 的荧光衰减曲线，通过最小二来法对荧光的衰减曲线进行拟合，得到 RsB 的荧光 寿命为 763 肘，与标准荧光染料对比一致. 关键词:荧光显微技术;荧光寿命;双光子激发;同步扫描相机;扫描速度;时间分辨率 中图分类号: TB 872; 0 43; Q 631 文献标识码:A 荧光显微技术是生命科学研究和临床诊断的重 要工具.荧光具有多参量特性，荧光光谱可反映样 品组分，荧光寿命可反映荧光分子所处微环境信 息.通过测量荧光寿命，可间接获得荧光分子所处 微环境内的生理生化参数[1] ，如 pH 值、离子浓度 (ci+ 和 K+ 等)和氧压等.荧光寿命测量和成像结 合可定量获取样品功能信息，具有直观、准确和信 息、全面等优点，已在生物物理、生物化学及临床医 学诊断等领域获得广泛应用[叫. 近年来，随着多光子激发技术的发展[町，荧 光光谱和荧光显微技术也取得较大进展.双光子激 发采用近红外光作为激发光源，具有对样品中焦点 以外区域的光漂白和光损伤小、荧光成像穿透深度 深、荧光激发波长范围宽、激发光与荧光容易分离 等优点.结合荧光寿命测量，双光子荧光显微技术 具有更高的时间分辨率和空间分辨率. 基于扫描相机的荧光寿命测量方法近年日趋受 到关注，渐显强大优势[8.11] 同步扫描相机具有时 间分辨率高、测量时间短、灵敏度高、适于高重复 频率微弱荧光信号的测量、可提供随时间连续变化 的信息以及能记录荧光衰减全过程等优点[9 ， 10] 本 文建立了一台基于同步扫描相机的双光子激发荧光 收稿日期: 2009-05-08; 修回日期: 2009-06-08 寿命显微测量系统.和文献 [12 ， 13J 中重复频率 为 1 MHz 的扫描相机系统相比，该系统采用重复频 率为 76 MHz 的同步扫描相机，可大幅提高光能利 用率.该系统具有时间分辨率高、非线性小、扫描 速度可调以及灵敏度高等优点.利用铁蓝宝石飞秒 激光器和一组标准具对系统的时间分辨率、扫描速 度和扫描非线性等参数进行了标定，并测量了荧光 染料 Rose Bengal 的寿命.实验结果表明，该系统 在不同扫描速度下具有皮秒量级的时间分辨率和良 好的扫描非线性特性，且荧光寿命的测量精度高. 这种基于高重复频率同步扫描相机的荧光寿命显微 测量技术，可在生物医学研究及临床诊断等领域得 到广泛应用. 1 实验系统及工作原理 本文所建立的双光子激发荧光寿命显微测量系 统如图1.该系统由铁蓝宝石锁模飞秒激光器、荧 光显微镜、样品台、同步扫描相机、光锥搞合 CCD 实时读出系统以及计算机等组成.扫描相机采用 S20 多碱阴极，光谱响应范围为 185 - 900 nm，灵 敏度为 100μAllm. 基金项目:国家自然科学基金资助项目( ;广东省科技计划资助项目 (2008a060205003 ) 作者简介:邵永红 (1972-) ，男(汉族) ，吉林省德惠市人，深圳大学副教授、博士. E-mail: shaoyh@szu.edu.cn 通讯作者:牛憨笨 (1940-) ，男(汉族) ，中国工程院院士、深圳大学研究员. E-ma山 hbniu@ szu. edu. cn etalon ，简称 FP 标准具) .标准具的前反射面在 800 nm 的反射率为 50% ，后反射面为 100% ，前后表 面严格平行. FP 标准具腔长为 20 mm，腔介质为 K9 玻璃.激光经过标准具后产生一列脉冲串，相 邻两个光脉冲的时间间隔 e.t 与玻璃片厚度 dg 和玻 璃的折射率 ng有关，即 e.t = 2n g d/ c . ( 1 ) 其中， c 为光在真空中