蛋白质与酶学教学 蛋白质与酶学2013绪论.pptVIP

蛋白质与酶学; 课程简介： 专业选修课 (D类) 36学时 2学分 时间：每周三 3-4节 地点：二主楼 B-301;课程内容： 一.蛋白质的检测和分离 二.蛋白质的功能及其结构基础 三.蛋白质组学 四.蛋白质工程和蛋白质的设计 五.酶学 六.应用酶学;第一章 蛋白质的检测和分离;第一节 蛋白质的检测和定量 一、化学方法 二、物理方法 三、生物方法 四、复合蛋白质中其他组分的检测 五、蛋白质定量的相对性;一、化学方法 （一）凯氏定氮法：通常蛋白质中氮元素的 含量约为17%。 （二）游离氨基酸：茚三酮显色反应（氨基 酸自动分析仪） （三）特异的显色反应：Arg、His、Ser﹑Lyr。 Folin酚试剂（Lyr残基侧 链的酚基） （四）双缩脲反应：肽键与铜氨离子形成复 合物。 检查肽键的特异方法;二、物理方法 （一）近紫外区： 1．芳香性氨基酸、Ser、Lyr：近紫外区275- 295nm有吸收。通常检测蛋白质的存在是 测定280nm的吸收。偶尔也可使用254nm测 定。 2．带有核酸或核苷酸衍生物的蛋白质，在 260nm的强烈吸收，会影响到280nm的吸 收。 3．二硫键含量高而Ser和Lyr含量较低时，在 270-250nm出现一个平坡。;(a)牛血清白蛋白的近紫外吸收光谱 (b)细胞色素P450近紫外和可见吸收光谱 (c)绿豆胰蛋白酶抑制剂的近紫外吸收光谱;（二）远紫外区 蛋白质有更强的吸收但特异性较差。 如果样品仅含有蛋白质且含量极低 时，测定200-210nm的吸收。 （三）有色蛋白质的特定吸收 Lyr和Ser在305nm和340nm附近被检测 到荧光。 （四）染料结合：考马斯亮蓝 （五）旋光色散和圆二色性：高级蛋白质结 构研究。;三、生物方法 （一）具有活性的蛋白质 （二）受体结合检测 （三）免疫检测：检测到抗原蛋白质的存 在，并不表明所检测的蛋 白质具有生物活性。因为 抗原的决定簇与蛋白质的 活性部位不一定是同一位 点。;四、复合蛋白质中其他组分的???测 糖类、脂类、金属以及其他辅基。 如:血红素等辅基与螯合的转铁蛋白结合。;五、蛋白质定量的相对性 “标准”曲线： 牛血清白蛋白并不标准。 绘制标准曲线所用的样品并不是研究对象。 凝胶电泳染色：蛋白质的显色强度也不能作 为蛋白质定量的绝对依据。 复合蛋白质：非氨基酸组分对蛋白质显色有 影响。 ;绝对定量最佳方法: 得到一定量的研究对象→脱水→恒重→准确称重→配制溶液→物理方法测定（280nm）→制作标准曲线;第二节 蛋白质的分离和纯化 一、蛋白质分离纯化的基础 二、蛋白质分离纯化的一般原则;一、蛋白质分离纯化的基础 （一）溶解度 （二）静电相互作用 （三）分子大小 （四）疏水作用 （五）生物活性 （六）配位键 （七）二硫键 （八）蛋白质分离方法的多重性;1．盐析 几乎所有的蛋白质，随着溶液中盐离子浓度的升高，水的活度降低，更多的水分子从蛋白质表面转移到离子的表面，使蛋白质分子相互作用的机会增多，进而导致蛋白质分子间相互作用，使得蛋白质沉淀。 最常用的无机盐是硫酸铵，有极大的溶解度，而且硫酸根离子是二价的。;等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？;盐析;硫酸铵沉淀;;盐析;分级沉淀：通过改变温度、pH以及逐步提高 盐浓度的方法，从蛋白质的混合 物中分离得到不同的蛋白质的级 分。 如：血浆中诸多蛋白质的分离，鸡蛋清中蛋 白质的分离。 ;2．有机溶剂分级 与水互溶的有机溶剂（最常用的是乙醇）加入到蛋白质溶液中，不仅可以改变水的活度，而且影响蛋白质结构中疏水和亲水的平衡。 由于有机溶剂改变了蛋白质的结构，故蛋白质沉淀的同时，也发生变性。通常0℃以下的低温中进行操作。 如：血浆中的蛋白质的分级。;3．两相分配 1)萃取法：利用分子在不同溶剂中溶解度不同的分离方法。