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谷丙转氨酶测定方法 一、赖式比色法 　　赖氏法并没有自己的酶活为单位定义。作者以当时卡门氏的速率法为准，测得多份不同ALT活力血清的ALT卡门氏单位。然后在赖氏比色法条件下，测得各份血清反应显色的吸光收值。将每份血清的卡门氏单位和对应比色法吸光值在坐标纸上作图。经过大量实验，对所有实验点以最佳曲线拟合，形成了比色法在某指定比色计上的标准曲线。坐标横轴为卡门氏单位，纵轴为吸光值，比色法结果和卡门氏速率法结果一致。继后作者以底物溶液及丙酮酸标准溶液，按照酶反应实际情况配制成不同浓度的丙酮酸标准溶液系列与2．4二硝基苯肼显色，并与速率法的结果比较。经多年反复实验，最后作者正式报告可通用于各种比色计的结果为ALT28卡门单位的鼍清在比色法条件下产生相当于0．1μmol丙酮酸，ALT57卡门单位的血清产生相当于0．2μmol丙酮酸，ALT97卡门单位? 的血清产生相当于0．3μmol丙酮酸。这样就使赖氏法标准曲，线上丙酮酸量和对应卡门单位确定下来。1970年将曲线延伸至150卡门单位。赖氏法报告的结果与速率法结果一致。没有条件采用速率法的实验室可以采用此法。 （一）赖氏比色法测定血清ALT 1、试剂 （1）Imol／L磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠(含两个结晶水)17.6g溶解于水中，并加水至1000ml，冰箱内保存。 （2）0.1mol／L磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾13.6g溶解于水中，加水至1000ml，冰箱内保存。 （3） 0.1mol／l磷酸缓冲液(pH7.4)：将420ml 0.1ml／L磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol／L磷酸二氢钾溶液混匀，置冰箱内保存。 （4） 底物缓冲液(DL—丙氨酸200mmol／L，α-酮戊二酸2m—mol／L)：精确称取1.79g DL-丙氨酸和29．2mgα-酮戊二酸，先溶于约50ml 0.1mol／L磷酸缓冲液中，用lmol／L氢氧化钠(约0.5m1)调到pH7.4，再加磷酸缓冲液至100ml，置冰箱保存，可稳定两周。 　　底物中可加入麝香草酚(每升底物加0.9g)防腐，置冰箱中至少可保存一个月。分装安瓿灭菌后，室温至少可用3个月。 （5）lmmol/L 2.4二硝基苯肼溶液：称取19.8mg 2.4二硝基苯肼，溶解于100ml lmmol／L盐酸中，置室温保存。 （6）0.4mol／L氢氧化钠溶液：将16.0g氢氧化钠溶解于水中，并加水至1000ml，置带塞塑料试剂瓶内???室温可长期稳定。 （7）2mmol／L丙酮酸标准液；准确称取22.0mg丙酮酸钠（AR），置于100ml容量瓶中，加0.05mol／L硫酸至刻度。 　　丙酮酸不稳定，容器开封后易聚合生成多聚丙酮酸，故宜使用可靠的市售丙酮酸标准液。 2．操作： 　　在测定前将底物在37℃水浴中预温5分钟，然后按表1操作。 　　表1　ALT赖式法测定操作步骤 加入物 测定管 对照管 血清（ml） 0.10.1底物溶液（ml） 0.5— 混均后，在37℃水浴箱中保温30分钟 2.4二硝基苯肼（ml） 0.50.5底物溶液（ml） — 0.5混均后，在37℃水浴箱中保温20分钟 0.4mol/L氢氧化钠溶液（ml） 5.05.0在505nm以蒸馏水调零点，读取各管的吸光值。测定管吸光值减去对照管吸光值后，从标准曲线查得ALT活力单位。 3、标准曲线绘制 （1）按表2顺序加液，制备AIT测定标准管 （2）各管加入2．4-二硝基苯肼溶液0．5ml，混匀，37℃保温20分钟后，加入0．4mol／L氢氧化钠溶液5．0ml。 （3）均匀，放置10分钟后：在505nm比色：以蒸馏水调零，读取各管吸光度。各管吸光值减去“o”管吸光值，所得差值 　　表2　赖式法测定ALT标准曲线的操作步骤 加入物管　号 401230.1mol／L磷酸缓冲液(m1)0.100.]00.100.100.102mmol／L丙酮酸标准液(m1)00.050.100.150.20底物缓冲液(m1)0.520.450.400.350.30相当于酶活力(卡氏单位)0285797150　　与对应的卡门氏酶活力单位作图。 4、参考值：5～25卡门氏单位 5、附注 　　卡门氏单位的定义系lml血清在卡门氏测定法规定的条件下，在温度32℃，每分钟能使反应液在340nm波长下吸光值降低0．00lA为一个卡门氏单位。 （二）赖氏比色法测定AST 　　血清中AST作用于由门冬氨酸和α-酮戊二酸组成的底物，在一定的反应条件下，生成一定量的草酰乙酸，草酰乙酸在反应过程中又自行脱羟生成丙酮酸。在酶反应到达规定时间时，加入2．4-二硝基苯肼，在酸性条件下，终止酶