第二章限制性内切酶.docx

第二章 限制性内切酶 HindII酶分子 R.E type内切酶与甲基化，酶分子不在一起识别位点4-6bp 大多数为回文对称结构切割位点在识别位点中或靠近识别位点限制反应与甲基化反应分开反应限制反应是否需要ATPNO命名法 命名时，依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）前三斜体。B am HⅠ Feature of recognition sequence ①对称性 回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，则产生平末端 ②Rotational symmetry 产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端 ③Written type a. Same sequence/same sites HindII HincII GTY/RAC MobI Sau3AI /GATC b. Same sequence/different site KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC AatII GACGT/C BsaHI GR/CGYC c. Different or same sequence/different or same site EcoRI G/AATTC ApoI R/AATTY HpaI GTT/AAC HincII GTY/RAC (R=A or G, Y=C or T) Isoschizomers（同裂酶）Same sequence was recognized by different restriction enzymes, resulting in same or different sticky end. Isocaudamer（同尾酶）Different sequence was recognized by different restriction enzymes, resulting in same sticky end. Site preferences (位点选择性) 在切割DNA 之前需要同时与两个识别位点作用;对要求作用的DNA 序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA切割激活另一个的变构位点（allosteric）。这两序列可由顺式（cis）方式提供，即相互靠近或形成环（loop）；或由反式（trans）方式提供，其变构位 点由含识别序列的寡核苷酸提供 How to use restriction enzyme 常规缓冲液一般包括提供稳定pH 值的缓冲剂、Mg++ 、DTT（二硫苏糖醇）以及BSA（小牛血清白蛋白） 1．缓冲液 pH 经常为7.0-7.9（在25℃ 时），用Tris-HCl 或乙酸调节； Mg++ 作为酶的活性中心， 由MgCl2 和MgAc 提供； 浓度常为10mM ；DTT 浓度常为1mM 。有时缓冲液中还要 加入100μg/ml BSA 。不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按 离子强度的差异分为高、中、低三种类型，离子强度以NaCl 来满足，浓度分别为 100mM 、50mM 和0mM 。 2．反应温度 反应温度大多数为37℃ ，一部分为50-65℃ ，少数25-30℃ 。高温作用酶在37℃ 下的活性会下降，多数仅为最适条件下的10-50% 。 3．反应时间 反应时间通常为1 小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。EcoRⅠ 若反 应16 小时，所需酶量为正常酶切时间的1/8 ，即若反应时间为16 小时，则所用酶 量为只切1 小时的1/8 。 4．终止酶切的方法 EDTA 可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10mM ；加热是常用的 方法，对于最佳反应温度为37℃ 的酶，在65℃ 或80℃ 处理20 分钟可使酶活性 大部分丧失。 How to avoid star activity High glycerol concentration（5%） High enzyme concentration（100U/μl） Low ionic strength(25mM) High pH (pH8.0) Presence of organic solvents PMSD （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺 （dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、sulphalane Presence of other divalent cation rather than Mg2+ 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性 How to choose restriction endonuclease based on genomic DNA (1