RPN4的生理功能及其降解研究(精选).docVIP

RPN4的生理功能及其降解研究 【摘要】：泛素-蛋白酶体降解系统一直是胞内用来清除异常的蛋白质和选择性降解各种生化过程中调控蛋白的执行者，它可以降解错误折叠的蛋白也可以及时更新细胞周期过程中的调控因子，对细胞的各种生化过程进行精密的调节，从而可以将胞内的蛋白质总量维持在一个相对恒定的水平，保证正常生命活动的规律性。芽殖酵母的RPN4(RegulatingParticleNoneATPase-4)基因，亦称SON1和UFD5，最开始是作为温度敏感株的抑制子Suppressor被发现的，即PRN4的失活突变可以恢复sec63-101在限制温度下的生长缺陷。后来发现，RPN4基因的突变还可以稳定泛素融合底物(UFDpathway的底物)UB-V-βgal，在不影响其多聚泛素化的情况下，阻碍26S蛋白酶体对它的降解，因此亦被命名为UFD5。以前的研究表明在蛋白酶体的32个亚基中有26个基因的上游启动子区域含有PACE(Proteasome-associatedcontrolelement)序列，而RPN4正是这段顺??转录元件的反式转录因子，并且其自身的降解也必须靠蛋白酶体来实现。这暗示了一种负反馈调控机制的存在：RPN4上调蛋白酶体亚基的水平，上调的亚基组装成有活性的蛋白酶体又反过来降解自身的转录激活因子，从而将其下游转录产物——蛋白酶体亚基维持在一个相对恒定的水平，保证细胞正常的生命活动。本论文的结果提供了直接的证据证明负反馈调控机制的存在，首先在两种不同的蛋白酶体活性受损的菌株内观察到RPN4蛋白的半衰期大大延长，稳定性明显升高，随后检测受其调控的下游蛋白酶体亚基的水平，发现与野生型相比，在蛋白酶体活性受损的突变型酵母菌株内其各个亚基的丰度都有大幅度提高，Northern检测证实这种升高是由转录水平的增强引起的并且随着RPN4稳定性的增加而增加。这些结果都表明在蛋白酶体活性受损的菌株内由于对RPN4的降解能力减弱，增加了RPN4在细胞内的丰度，上调了其各个亚基的转录水平，从而在数量上对胞内受损的蛋白酶体给与补充，使其达到新的动态平衡，维持细胞正常的蛋白酶体活力水平。之后我们做了大量的酵母菌株表型测试试验，结果与预想的一致，在蛋白酶体单亚基突变造成的活性受损菌株中酵母的存活率与生长速度都与野生型相差无几，但是当在实验中同时损伤蛋白酶体的活性并去除RPN4介导的负反馈调控机制之后，菌株就表现出强烈的合成致死效果，存活率大大降低，生长速度也十分缓慢，可见在RPN4缺失的情况下，受损的蛋白酶体无法在数量上得到补给，给菌株的生长带来了毁灭性的灾害。此外，为了研究蛋白酶体【关键词】：RPN4蛋白酶体泛素依赖性降解UBR2RAD6负反馈调控 【学位授予单位】：华东师范大学 【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2006 【分类号】：Q936 【目录】：中文摘要9-12英文摘要12-17第一章RPN4对26S蛋白酶体的负反馈调控17-34摘要17-18前言18-19材料与方法19-23结果23-261.26S蛋白酶体活性受损稳定了RPN4并导致其下游基因PRE6表达量上升232.26S蛋白酶体活性受损导致其自身亚基的转录水平上升23-243.26S蛋白酶体活性受损的菌株内亚基表达量的升高是RPN4依赖性的244.RPN4稳定性的增强可以直接诱导蛋白酶体亚基表达量升高24-26讨论26-27版图与说明27-34第二章RPN4-蛋白酶体负反馈调控对蛋白酶体突变株存活和生长的影响34-45摘要34-35前言35-36材料与方法36-37结果37-391.在蛋白酶体活性受损的菌株内同时缺失RPN4会导致强烈的合成致死37-382.在RPN4基因缺失的菌株内表达末端带有TAG的蛋白酶体亚基PRE2同样导致强烈的合成致死38-393.精确测量上述不同基因型的子代酵母和亲本酵母在生长速度和存活率方面的差异39讨论39-42版图与说明42-45第三章DNA损伤修复中的RPN4-蛋白酶体反馈调控45-57摘要45-46前言46-47材料与方法47-49结果49-501在DNA损伤试剂MMS作用下,蛋白酶体表达量的上升是RPN4依赖的49-502验证在DNA损伤试剂MMS作用下,RPN4-蛋白酶体反馈调控机制的存在50讨论50-52版图与说明52-57第四章RPN4泛素依赖的降解途径的E3-UBR2的发现57-68摘要57-58前言58材料与方法58-59结果59-611在所有已知的E3中,只有UBR2的缺失才能稳定RPN4(11-229)59-602UBR2的缺失使得全长RPN4的稳定性增强60-61讨论61-62版图与说明62-68第五章RPN4多聚泛素化反应中E2的发现以及体外重建整个泛素化反应过程68-81摘要68-69前言69-70材料与方法70-73