猪 Siglec-10基因的克隆与生物信息学分析.pdfVIP

动物医学进展 。2014，35(1I)：14一I9 Progress in Veterinary M edicine 猪 Siglec一1 0基因的克隆与生物信息学分析 张 毅 ，张 晏 ，王晓杜 ，方维焕 ，温贵兰h (1．贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025； 2．浙江大学动物预防医学研究所 ，浙江省动物预防医学重点实验室，浙江杭州 310058) 摘 要：为了研究猪 Siglee-10(pSiglec一10)的分子生物学特征，利用Ensemble网站提供的预测序列 (ENSSSCTOOOOOO3246O)设计一对特异性 引物 ，采用 RT—PCR技术，克隆 pSiglec一10分子的全长 CDS区，经 过测序 比较鉴定正确后 ，对该分子的基本特征进行分析；构建截短 pSiglec一10的原核表达载体 ，另将该分子 的 CDS区全长克隆至真核表达载体 pcDNA3．1—3 FLAG，将重组质粒转染至 PK一15和 Marc一145细胞 中分 析其表达定位特征 。结果克隆的 pSiglec一10分子的全长 CDS为 2 127 bp，编码 709个氨基酸；pSiglec-10基 因序列与猴的同源性最高，同源性达 73．6 ，与鼠的同源性为 66．9 ；与人的同源性为62．5％，氨基酸序列 的同源性分别为 58．9 、69．4 和 65．3 ；pSiglec一10 C端的 ITIM 区域和磷 酸化位点高度保 守；pSiglec一10 分子具有较好的抗原特性和亲水性；该分子主要表达定位在细胞浆中，在 Marc-145细胞中呈不连续的点状 分布于细胞浆，细胞核周围荧光强度较强。pSiglec一10分子全长 CDS区的克隆和分析将对该分子的功能研 究提供一定的理论依据 。 关键词：猪 Siglec一10；分子克隆；真核表达；生物信息学分析 中图分类号 ：Q78；$858．28 文 献标识码 ：A 文章编号 ：1007-5038(2014)11-0014—06 唾液酸结合的免疫球蛋 白样凝集素 (sialic acid binding Ig-like lectin，Siglec)分子家族为工型凝集素， 是在研究唾液酸黏附素(Siglec-1／CD169)时发现的， 属于I型跨膜蛋白，主要分布在免疫细胞，如 B细胞、T 细胞和NK细胞等I1]。在人和鼠体内已经发现了 1O 多种该家族的分子，它们具有以下共同特点_2_3_：①位 于胞外的N端具有 V型 Ig(immunoglobulin)结构域， 都能够与唾液酸结合；②胞外部分具有数量不等的 C2型 Ig样结构域；③大多数分子的胞内区具有高度 保守的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)和酪氨酸磷酸化 位点。Siglec-g是近年在小鼠中发现的 Siglecs家族基 因，Siglec-G(人的同源分子是 Siglec-10)分子主要分布 在 B细胞，是BCR相关信号通路的负调控分子_4]，其 胞内C端具有 ITIM基序，具有保守的酪氨酸磷酸化 位点，其功能与抑制受体的作用相似，能够抑制细胞 的激活信号，与携带有免疫受体酪氨酸活化基序(im— munoreceptor tyrosine-based activated motif，ITAM)的 分子调控细胞信号的抑制与激活。研究表明，水疱性 口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)能够特异 性的利用Siglec-G分子介导 RI 1分子的降解，阻断 RIG-1分子的下游信号传递，从而抑制 RIG-1信号通 路诱导的I型干扰素产生，逃避宿主天然免疫防御[5]。 为研究与 鼠 Siglec-G分子 同源的猪 Siglec-10 (pSiglee-10)在抗病毒天然免疫中的作用，为动物病毒 如猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)等 的免疫抑制机 制研究提供新的思路，我们从猪脾脏组织中抽提总 RNA反转录制备 eDNA，依据 Ensemble(htp：／／asia． ensemb1．org／index．htm1)数据库预测的核酸序列设计 特异性引物，并利用 RT-PCR技术克隆目的基因，获 得了 pSiglec-10分子的全长 CDS(coding sequence)；并 构建真核表达载体 pcDNA3．1-3 FLAG-pSigec-10和 原核表达载体 pET30a(+)-pSigec-10，分析该分子的 生物信息学特点和细胞定位，为进一步研究 pSiglec- 1O分子的功能奠定一定的基础。 1 材料