分子生物学讲座-9幻灯片1.pptVIP

第二节 基因工程载体 ;①能在宿主细胞中复制，而且最好要有较高的复制能力。 ②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。 ③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体上要有合适的酶切位点。 ④容易从宿主细胞中分离纯化出来。 ⑤有容易被识别筛选的标志。 ;二、载体的种类;常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。 一、质粒载体 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： ①是染色体外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circuar DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300 kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ;②能自主复制，是能独立复制的复制子。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类： 严紧控制（stringent control）型：复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞只有一个到十几个拷贝； 松弛控制（relaxed control）型：复制和宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。;③质粒对宿主生存并不是必需的。 这点不同于线粒体，线粒体DNA也是环状双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部分，质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖 。;;;;二、噬菌体载体;;; λ噬菌体由头和尾构成，DNA装在头部蛋白质外壳的里面。其基因组长48502bp，为线性双链DNA。 λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖 。;①溶菌性方式（lytic pathway）：在营养充足，条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，λDNA经多次复制合成许多子代λDNA，于是装配成许多子代的λ噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的λ噬菌体。 ②溶原性方式（lysogenic pathway）：进入细菌的λDNA可整合(integrate）入细菌的染色质DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体(prophage)，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌(lysogen)。λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。 ;;2、基因组 λ噬菌体整个基因组可分为三个部分： ①左臂：长约20kb，编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。 ②中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。 ③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。 左右臂是必需的，中段是非必需的 。在中段插入外源基因不影响它的增殖，这是作为载体的基础。;3、应用 作为载体，但天然不行，需要改造;一般地，基因工程操作可以分为四个步骤;1、目的基因的概念 符合人们要求的DNA片段，被称为目的基因。;（1）基因组DNA文库 从细胞中提取出全部DNA，用物理方法（超声波等）或酶法（内切酶不完全酶解）将DNA降解成大小不等的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库（genomic DNA library）。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。;基因组DNA酶切;;（2）cDNA文库 提出细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。; cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得