柱层析介绍概念.ppt

柱 层 析 简单的介绍;目 录;一、层析的原理;（二） 层析的基本概念;（三） 层析的分类;二、柱层析的基本操作;层析柱分离物质的示意图;不同物质分配系数不同时;(二) 几个基本概念;（三）基本操作步骤;1、装柱; 常用的装柱方法有干装法和湿装法两种 （1）干装法 在柱内装入2/3 溶剂，在管口上放一漏斗，打开活塞让溶剂慢慢地滴入锥形瓶中，接着把干吸附剂经漏斗以细流状倾泻到管柱内，同时用套在玻璃棒（或铅笔等）上的橡皮塞轻轻敲击管柱，使吸附剂均匀地向下沉降到底部。填充完毕后，用滴管吸取少量溶剂把粘附在管壁上的吸附剂颗粒冲入柱内，继续敲击管子直到柱体不再下沉为止。柱面上再加盖一薄层洁净细砂，把柱面上液层高度降0.1~1cm，再把收集的溶剂反复循环通过柱体几次，便可得到沉降得较紧密的柱体。 （2）湿装法 基本方法与干装法类似，所不同的是，装柱前吸附剂需要预先用溶剂调成淤浆状，在倒入淤浆时，应尽可能连续均匀地一次完成。如果柱子较大，应事先将吸附剂泡在一定量的溶剂中，并充分搅拌后过夜（排除气泡），然后再装。其优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 无论是干装法，还是湿装法，装好的色谱柱应是充填均匀，松紧适宜一致，没有气泡和裂缝，否则会造成洗脱剂流动不规则而形成“沟流”，引起色谱带变形，影响分离效果。 ;2．加样;3．洗脱与检测; 对洗脱液接收时，有色物质，按色带进行收集，但色带之间两组分会有重叠。对无色物质的接收，一般采用分等份连续收集，每份流出液的体积毫升数等于吸附剂的克数。若洗脱剂的极性较强，或者各成分结构很相似时，每份收集量就要少一些，具体数额的确定，要通过薄层色谱检测，视分离情况而定。现在，多数用分步接收器自动控制接收。 洗脱完毕，采用薄层色谱法对各收集液进行鉴定，或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线把含相同组分的收集液合并，除去溶剂，便得到各组分的较纯样品。;（四） 硅胶柱、大孔吸附树脂柱、聚酰胺柱;2.大孔吸附树脂柱;ⅲ.洗脱 化合物经树脂吸附之后，在树脂表面或内部还残留许多非极性或水溶性较大的强极性杂志成分，一般用水洗去。为避免损失影同步检测，然后再用解吸附剂洗脱。注意若解吸附剂中有机部分浓度较高，应采用梯度洗脱，逐步增大浓度，否则，树脂床中易产生大量气泡而影响洗脱。;3. 聚酰胺柱;三、柱层析常见问题与对策;1. 硅胶 最常用的吸附剂,通常用SiO2.xH2O表示,是具有硅氧交联结构,表面有许多硅醇基的多孔性微粒.硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力.硅胶具有微酸性,适用于分离酸性和中性物质,如有机酸、氨基酸、甾体等.水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性,经加热可被除去的水称自由水,若自由水含量达17%以上,则吸附力极低,此时,硅胶只能用于分配层析.若将硅胶在105-110℃加热30min,吸附能力显著增强，这一过程称为活化.如果将硅胶加热到500℃，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。 2. 氧化铝 分酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝(pH4-5)适合于分离酸性化合物，碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物，中性氧化铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定的甙类、酯类等化合物.氧化铝用前也需脱水活化，通常于400℃高温下加热6h,使氧化铝的含水量在0%-3%之间,可得到Ⅰ级或Ⅱ级氧化铝，但温度过高也会破坏氧化铝的内部结构。 3. 大孔吸附树脂聚酰胺 大孔吸附树脂广泛应用于制药及天然植物中活性成分,如皂甙、黄酮、内脂、生物碱等大分子化合物的提取分离；聚酰胺在黄酮类物质、茶多酚、醌以及贵金属分离提取中有着广泛的应用。 4. 羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2，简称HA]的吸附容量高，稳定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。;(二) 洗脱剂的选择; 洗脱剂可根据分离物中各成分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择。所用洗脱剂的浓度大小和极性强弱的选择，需通过试验确定。 在实践中，选择洗脱剂的顺序是由极性小到极性大(正向层析)。当把极性小的洗脱剂换成极性大的时，宜先将极性大的和极性小的洗脱剂混合使用，浓度则由低到高。总之，选用洗脱剂的原则是能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、洗脱时间短。 ;(三) 操作方式;气泡的产生与排除;2. 上样和洗脱 加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床