尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序的论文.docVIP

　　尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序的论文 作者：唐松山，唐治华，李红枝，游娟 【摘要】 目的 测定agacutin两个相近亚基的n端15个氨基酸残基序列，酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序。方法 通过生物化学方法获得高纯化agacutin，经sds电泳分离、亚基胶条回收及pvdf膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品，后者通过edman降解法，测定了亚基n端15个氨基酸残基序列。结果 大亚基(16 kda)的序列为：dcssginuses of the close tethods the single subunits of agacutin an degradation method ined to be dcssgbinlike enzyme. 　　key ; thrombinlike enzyme; subunit separation; protein nterminal sequencing. 　　蛇毒含有许多特殊蛋白酶和活性多肽,这些酶可能作为支持物质参与消化，并且也是蛇毒神经毒和出血毒的主要原因。.cOm自1995年以来，一系列对血液凝固系统起作用的结构和功能多样性的酶自尖吻蝮蛇蛇毒中被纯化。1995年,chen yl等[1]纯化了agkicetin(14和15 kda的异二聚体)，它具有gp1b拮抗剂和血小板抑制活性;1998年,yeh ch等[2]纯化了accutin(5.241 kda)，一个新的整合素成员，它潜在性地抑制血小板聚集;1999年，huang qq等[3]报道了类凝血酶acuthrombina(28 kda)和acuthrombinc(69 kda);cheng x等[4]纯化了纤维蛋白溶解酶agkisacutacin(14和15 kda的异二聚体);pan h等[5]成功克隆了acutin(38 kda)，一个具有去纤化功能的类凝血酶;2000年，xu xl等[6]报道了2个抗凝血类凝血酶acfi (anticoagulation factori)和acfⅱ(anticoagulation factorⅱ)(14.6和14.7 kda的异二聚体);2001年,yeh ch等[7]报道了血小板糖蛋白ib拮抗剂agkistin(16.5和15.5 kda的异二聚体)和liang xx等[8]报道了纤溶酶fⅱ(a)(26 kda);2003年，郑颖等[9]纯化了2个类凝血酶;2004年,李婷等[10]纯化了抗凝血功能的类凝血酶(14.4和17 kda的异二聚体); 吴忠和苏薇薇报道了具有止血活性的类凝血酶halase[11,12]。 　　自1993年起，本课题组尝试从尖吻蝮蛇蛇毒中分离具有止血功能的类凝血酶。目前，已获得5个以纤维蛋白原为底物的酶，进一步的研究发现，至少有2个酶具有止血活性，agacutin是被研究的最全面的一个。本文报道了agacutin的亚基拆分和n端15个氨基酸残基序列测定。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂 　　聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂、tris和caps{3[cyclohexylamino]1propanesulfonic acid} 购自promega公司;pvdf膜为biorad公司产品;可逆性蛋白质快速染色试剂盒为北京天为时代科技有限公司产品;agacutin类凝血酶由昆明龙津药业有限公司提供;其余试剂为国产分析纯。 　　1.2 仪器 　　miniprotean cell电泳槽、mini transblot电转移槽和poa恒流预电泳2 h,上样后以200 v恒压电泳45 min。 　　1.3.2 可逆性蛋白快速染色 用蒸馏水冲洗电泳后凝胶，将胶置于玻璃培养皿中，加染色液50 ml,震荡5 min。待胶条带显现后，用蒸馏水冲洗2～3 min，洗去多余染液。将显色后的胶置于玻璃平板上，以黑色为背景，仔细切割分离亚基胶条。将回收的亚基胶条放入脱色液(0.25 mol/l trishcl,0.25 mol/l edta,ph 8.5)脱色20 min。条带消失后，用蒸馏水冲洗胶条并进行蛋白回收或电转移。 　　1.3.3 蛋白回收 将含2种亚基的胶条分别放入排阻分子量为10 kda的10 mm透析袋的一端，充满透析液，扎紧。将含胶条的一端置于水平电泳槽的阴极，在sdspage电泳缓冲液中120 v恒压2 h，再反向电泳1 min。剪去含胶条一端的透析袋，用缓冲液反复冲洗另一端的透析袋，回收缓冲液，用于鉴定单亚基的纯度或实行电转移。 　　1.3.4 单亚基纯度鉴定 采用sdspage电泳(t∶c=15∶3.9)，经考马斯亮蓝r250染色，并用脱色液脱至本底无色。 　　1.3.5