反相高效液相色谱法测定Arthrobacter sp.黄嘌呤氧化酶活性.pdfVIP

第 26 卷第 8 期 分析试验室 VOI .26 . NO .8 2007 年 8 月 Chinese JOurnaI Of AnaIysis LabOratOry 2007 - 8 反相高效液相色谱法测定 Arthrobacter sp . 黄嘌呤氧化酶活性 李忠琴l ，许小平2 ，王 武!l （l . 江南大学工业微生物教育部重点实验室，江苏 2l4036；2 . 福州大学化学化工学院，福建 350002） 摘 要：报 道 了 采 用 反 相 高 效 液 相 色 谱 法（RP-HPLC）测 定 节 杆 菌（ Arthrobacter sp . ）黄嘌呤氧化 酶 活 性 的 有 效 方 法。将 酶 初 提 液 与 含 有 黄 嘌 呤 的 反 应 体 系 在 37 C 下反应 20 min，反应终止后通过 HPLC 测定产物尿酸生成量的变化来分析 酶的活性。通过流动相组成、pH 和柱温等分离条件的优化，确定了最佳的色谱 检测条件以 （ ， ）溶液为流动相，流速 ，柱温 NH4 H2 PO4 50 mmOI/L pH 7 .5 l mL/min 25 C ，检测波长 290 nm。为深入研究微生物细胞内黄嘌呤氧化酶提供了高效检 测手段。 关键词：反相高效液相色谱法；黄嘌呤氧化酶；活力测定 中图分类号：O657 .7 文献标识码：A 文章编号：l000-0720（2007）08-04l-04 黄 嘌 呤 氧 化 酶（ Xanthine Oxidase，简 称 XOD， 中的溶解度很低，需加入明胶、SDS 或 TritOn X-l00 EC l .l .3 . 22）是 嘌 呤 核 苷 代 谢 途 径 的 限 速 酶，在 作为稳定 剂，影 响 了 测 定 结 果 的 准 确 性；PMS 对 氧气存在下自动催化发生氧化反应，产生氧自由 XOD 的活性具有一定的影响，在较 高 浓 度 下 无 法 基。其与痛风、高尿酸血症、缺血性再灌注损伤、 准确测定 XOD 活力；且 NBT、MTS 和 PMS 试剂昂 风湿 性 关 节 炎、心 肌 梗 塞、肝 炎 等 疾 病 密 切 相 贵，检测费用高。由于 XOD 反应体系中黄嘌呤和 关［l ~ 3］，因而倍受关注。目前已作为高价值的临床 尿酸 均 有 紫 外 吸 收 作 用，且 波 长 较 接 近，如 果 不 诊断 用酶，应用于检测血清无机磷、血清超氧化 分离，就 直 接 采 用 紫 外 分 光 光 仪 检 测，造 成 相 互 物歧化酶活性、细胞损伤后胞外次黄嘌呤和黄嘌 影响，降 低 测 定 酶 活 的 准 确 性。本 文 根 据 黄 嘌 呤 呤水平以及次黄嘌呤核苷（肌苷）、鸟嘌呤、鸟苷、 氧化酶催化 反 应 特 性，利 用 高 效 液 相 色 谱 定 量 分