流动注射光度法测定黄酒中蛋白质的含量和分子量分布.pdfVIP

流动注射光度法测定黄酒中蛋白质的含量和分子量分布 林 峰＊ 白少勇 （浙江大学化学系，杭州 310028） 摘 要 将流动注射技术引入 Bradford 蛋白质测定法，利用 Sepadex G-100 凝胶层析柱分离黄酒中的蛋白质， 可直接测定蛋白质的含量和分子量分布。成品酒（ 熟酒）为 5. 32 g / L（6. 86 g / L）；高分子蛋白质（ FW 25000）占 10. 52%（13. 08% ）；中分子蛋白质（FW：25000 ~ 5000）占 49. 12%（54. 12% ）；小分子蛋白质（ FW 5000）占 40. 36%（32. 80% ），并得到黄酒中蛋白质含量与分子量分布的曲线谱图，可监控和预测黄酒的品质。 关键词 流动注射分析，Bradford 蛋白质测定法，黄酒 2004-09-20 收稿；2005-05-16 接受 本文系 2002 年浙江省科技计划资助项目（No. 2002C31059） ! 引 言 黄酒中蛋白质的含量是黄酒品质的重要指标之一，它与黄酒的非生物稳定性和保质期有关，也影响 黄酒的风味。目前，黄酒生产厂家一般采用凯氏定氮法测总氮，然后换算成蛋白质含量［1］；或用隆丁 （Lundin）区分法测定高、中、低蛋白质分子的含量。但是这些测试方法不仅操作繁琐、重复性差，而且所 得数据不能真实、准确地反映黄酒中蛋白质的含量和分子量分布情况。为此，本实验将流动注射分析技 术运用到 Bradford 蛋白质测定法［2］中，研制开发了一种测定黄酒蛋白质的新技术。该技术只需对黄酒 样品进行简单的过滤处理，即可进样自动分离、检测和记录，得到代表黄酒蛋白质含量和分子量的分布 曲线。应用该技术既可监控黄酒生产工艺过程中蛋白质的含量和分子量分布情况，也可预测成品酒的 品质，有效地控制黄酒的非生物稳定性。 # 实验部分 #. ! 仪器与试剂 流动注射分析系统（自组装）；VIS-7220 型可见分光光度计（ 北京瑞利分析仪器公司）；色谱工作站 （杭州天辰仪器有限公司）。凝胶层析柱：1. 65 cm X 45 cm，Sepadex G-100（40 ~ 100 ! m，pharmacia）；洗 脱液：0. 05 moI / L KCI + 0. 05 moI / L Hac-Naac，pH = 4. 0；显 色 液：称 取 Coomassie BriIIiant BIue 图 1 黄酒蛋白质分离检测工作流程示意图 Fig. 1 The sketch map of working principIes on determining protein of rice wine G-250 显色剂 100 mg，加入 50 mL 95% 乙醇至溶解，再加入 85%（! #）磷酸 100 mL，用蒸馏水稀释至 1000 mL。牛血 清白蛋白（FW：67000）为上海华美生物工程公司进口分装 产品，卵白蛋白（ FW：43000）、马血红蛋白（ FW：12500）和 牛胰岛素（FW：5733. 5）均为 Sigma 公司产品，其它所用的 试剂均为分析纯。 #. # 实验方法 流动注射光度法测定黄酒蛋白质的工作流程度如图 1 所示。将测试装置的各部分用内径为 1. 25 mm 的聚四氟 乙烯管连接并设定以下参数：检测波长 595 nm，泵速 2. 0 mL / min，流动比色池体积 100 ! L，进样体积 1 mL，采样频 率 1（次）/ s，60s 取一个平均值，采样时间 120 min。实验开 始时开启蠕动泵，将显色液和洗脱液吸入管道系统，洗脱液经凝胶层析柱在三通阀与显色液混和，流入 反应线圈内发生显色反应，然后进入检测器。以不含蛋白质的洗脱液与显色液的混和液作为参比液，待 第 33 卷 2005 年 10 月 分析化学（FENXI HUaXUE） 研究简报 Chinese JournaI of anaIyticaI Chemistry 第 10 期 1459 ~ 1461 基线平稳后注射样品，即可分离和检测黄酒中的蛋白质。在电脑色谱工作站记录的洗脱曲线上可以看 到黄酒中蛋白质的含量和分子量分布情况。根据凝胶层析法的原理，最先被洗脱的是大分子蛋白质，然 后是中分子蛋白质，最后出来的是小分子蛋白质。因此，洗脱曲线上的横坐标（即保留时间）与黄酒蛋 白质的分子量相对应，纵坐标（!）与黄酒蛋白质的含量（ ! g）相对应。 本实验采用牛血清白蛋白（FW：67000）、卵白蛋白（FW：43000）、马血红蛋白（FW：12500）和牛胰岛 素（FW：5733. 5）4 种蛋白质标样的保留时间为标准，通过对照实验法，设定蛋白质分子量的标尺，用以 确定洗脱曲线上蛋白质的分子量大小