荧光原位杂交技术在污水生物处理中的应用.docVIP

宁波大学硕士研究生09/10学年第一学期考试答题纸 考试科目： 实验生态学 课程编号： 考卷类型：（A/B） 姓名： 陈蕾 学号： 0911071155 阅卷教师： 陆开宏 成绩： 91 荧光原位杂交技术在污水生物处理中的应用 陈蕾 （宁波大学 海洋生物工程重点实验室，浙江 宁波 315211） 摘要：荧光原位杂交技术（FISH）是一种在医学方面已经较成熟的技术，目前已经越来越多地应用到了研究微生物生态中。近年来，对污水处理的研究已经从简单研究污水处理的表征现象转移到更深入地研究污水内部微生物种类及其特性。该文综述了荧光原位杂交技术的背景、原理、实验步骤及其在污水处理微生物生态学检测中的应用。 关键词：荧光原位杂交技术；污水生物处理；微生物生态学 目前，在环境综合治理如废水、废气和固体废弃物的净化和处理中已经广泛应用生物学方法。在污水处理中需要进一步处理难降解的有机物、氮、磷等能够导致水体富营养化的可溶性无机物等。而微生物是废水生物处理过程中的作用主体，通过新陈代谢过程，具有分解和矿化有机物的能力。研究活性污泥及生物膜微生物生态系统的组成、结构与功能，能进一步提高微生物对有机污染物的降解能力，从而提高废水的生物处理效率[1]。在污水净化和污染水环境生物修复领域，已研发和应用了许多技术经济性能良好的生物除磷、脱氮系统，如Bardenpho工艺、SBR系列、氧化沟工艺和A/A/O工艺等技术[2]。近几年，随着分子生物学技术如分子杂交、PCR、核酸测序等的发展，污水内部微生物灵敏的检测和精确的细菌鉴定成为可能。其中荧光原位杂交（fluoresce- nce in situ hybridization， FISH）技术成为识别除磷细菌、硝化细菌和脱氮细菌的有效方法之一。FISH在研究污水除磷、脱氮处理、优化系统氮磷去除效果时有重要的应用。适当运用FISH等先进的分子生物学检测手段，能准确地表现污水处理反应器中脱氮菌群落的类型和结构形态。有助于通过生物法去除污水中的磷、氮、有机物等[3]。 荧光原位杂交技术（FISH）的背景及研究现状 1969年，Pardue和John两个研究小组建立了原位杂交技术（ISH），这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，检测出细胞内特定核酸序列，即采用DNA或RNA探针，通过原位杂交的方法，将特定的DNA或RNA序列在细胞或染色体上显示出来[4]。最初是采用同位素标记的方法，通过放射自显影，将已结合在靶位上的探针显示出来。后来改进了标记的材料，用包括荧光酶、地高辛、生物素等荧光物质代替了同位素，从而形成了荧光原位杂交（FISH）技术[5]。 随着标记手段、检测试剂、荧光观察等技术的发展，FISH技术的应用范围在不断扩展，利用FISH技术不仅可以鉴定和定量分析特异微生物，还可用于诊断微生物群落结构与群落动态；结合其它研究手段，还可用于研究复杂环境中的原位基因表达，如启动子诱导及其表达的时序进程、生物膜上微生物的空间分布、混合菌群中特定生物的代谢活性；基因转录、重排、扩增，基因组结构与调控，哺乳动物的染色体进化研究及亲缘关系，以及在污水处理微生物生态学检测等领域都起到了重要的作用[6]。 荧光原位杂交技术（FISH）的原理及基本操作步骤 荧光原位杂交技术（FISH）是将细胞原位杂交技术和荧光技术有机结合而形成的，其原理是按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量[7]。其实质是基于核酸分子的变性和选择性退火。双链DNA或处于二级结构的DNA分子被变性回复到单链、线性的形式后，与带有互补的核苷酸链退火杂交形成双链结构[8]。FISH技术通常选择在系统发育上具有保守性的16SrRNA作为探针结合对象。16Sr RNA的保守性是相对的，不同细菌的16SrRNA序列有着不同程度的差异，针对目标微生物体内某段有差异的序列设计出相应的寡核苷酸探针，就可以实现对目标微生物的原位检测。目前，荧光原位杂交在微生物系统发育、微生物诊断和环境微生物生态学研究中应用较多。利用对rRNA（主要是16S和23S rRNA）序列专一的探针进行杂交已经成为微生物鉴定的标准方法[9]。FISH技术应用于污水处理中具有下列特点：操作简便、探针标记后稳定；方法敏感，测定迅速；可同时用多种探针检测同一个标本；不仅可以定性，而且可以对水环境中的硝化细菌、除磷细菌和脱氮细菌进行直接计数，为检测硝化系统中硝化细菌类群的空间和数量分布，准确地表现污水