靶向骨桥蛋白shRNA表达载体的构建与鉴定的论文.docVIP

　　靶向骨桥蛋白shRNA表达载体的构建与鉴定的论文 【摘要】 目的 通过构建骨桥蛋白(osteopontin，opn)shrna表达载体，探索卵巢癌基因治疗新途径。方法 根据基因库上的opn-mrna序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用 t4dna连接酶连接到线性化的psilence质粒中,并对重组质粒进行酶切及序列鉴定。结果 opnsirna表达载体克隆构建成功，插入片段测序结果与合成的sirna结果一致。结论 靶向opn shrna表达载体的构建成功为研究降低卵巢癌opn表达的抗肿瘤效应，及与放化疗的协同效应打下了基础。 【关键词】 骨桥蛋白;shrna;表达载体;卵巢癌 construction and identification of targeting osteopontin shrna expression vector 　　xu ent of gynecology obstetrics, affiliated hospital of xuzhou medical college, 　　xuzhou, jiangsu 221002, china) 　　abstract: objective to explore the neethods on the basis of opn-mrna geic sequence database, an oligonucleotide chain consisting of 64 bases restriction sites at both ends id psilence e digestion of rebinant plasmid and sequencing.result the opnsirna express vector cloning otherapy. 　　key bion公司，该载体含有人h1启动子，包括bamhⅰ及hindⅲ酶切位点。 　　大肠杆菌dh-5α购自碧云天生物有限公司。bamhⅰ、hindⅲ、t4 dna连接酶购自mbi公司，质粒小量提取试剂盒购自tiangen生物公司。dna凝胶回收纯化试剂盒购自promega公司。 　　1.2 实验室及仪器 本实验在徐州医学院肿瘤生物治疗实验室完成。pcr仪(eppendorf公司)，高速离心机(eppendorf公司)，电热恒温水槽(上海跃进医疗器械厂)，摇床(太仓市实验设备厂)。 　　1.3 方法 　　1.3.1 sirna设计与合成 根据genebank收录的骨桥蛋白的基因序列(nm000582)作为分析序列，采用ambion公司的网上设计软件()，参考sirna设计原则[4]，选择最佳干扰位点，本研究选取的靶位点是：acaggctgattctggaagt;agccaatgatgagagcaat;针对靶位点分别设计两条互补的寡核苷酸序列，寡核苷酸的两端带有与bamhⅰ和hind ⅲ酶切位点互补的粘端序列，能够直接与经bamhⅰ和hind ⅲ酶切的载体连接。并通过blast对所选择的靶序列进行同源分析,排除sirna非特异性抑制其他基因片段的可能。shrna序列茎环结构为9个与opn基因不互补的非同源碱基(ttcaagacg),末端终止子为tttttt 。设计的具有发夹结构的shrna干扰片段序列如下。结构模式为:bamhⅰ+sense+loop+antisense+终止信号+hindⅲ。共设计了2对opn特异性sirna编码序列,如下： 　　opn-shrna1:5′gatccgacaggctgattctggaagtttcaagagaacttccagaatcagcctgt t 　　tttttggaaa-3′; 　　反向互补序列：5′agcttttccaaaaaaacaggctgattctggaagttctcttgaaacttccagaatc 　　agcctgtcg-3′; 　　opn-shrna2:5′gatccgagccaatgatgacagcaatttcaagagaattgctgtcatcattggctt 　　tttttggaaa-3′; 　　其反向互补序列:5′-agcttttccaaaaaaag 　　ccaatgatgacagcaattctcttgaaattgctgtcatcattggctcg-3′。 　　阴性对照序列:以上寡核苷酸序列单链由上海生工生物工程公司合成。 　　1.3.2 双链寡核苷酸的合成 将合成的单链寡核苷酸溶解于无核酶水中，终浓度为1 g/l。将互补的两条寡核苷酸各取2 μl，加入46 μl的退火缓冲液，置pcr反应仪上，设定反应条件为：90℃ 3 min，37 ℃1 h，得到退火产物。-20℃保存备用。 　　1.3.3 ps