陆地棉转录因子GhNAC7的克隆及功能分析_郑学伟.docVIP

陆地棉转录因子GhNAC7的克隆及功能分析_郑学伟 中国农业科学 2017,50(3):426-436 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.03.002 陆地棉转录因子GhNAC7的克隆及功能分析 郑学伟1,2，SHAH Syed Tariq，范术丽，魏恒玲，庞朝友，李鸿彬，喻树迅 222212 （1石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832000；2中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳 455000） 摘要：【目的】从陆地棉中克隆GhNAC7，分析其结构和功能，研究其在棉花不同组织中以及叶片不同发育时 期的表达量。并转入拟南芥进一步探究其在棉花叶片衰老过程中的作用。【方法】利用中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室建立的棉花衰老叶片cDNA文库中的序列，获得1个含有NAM结构域的EST，使用Oligo 6.71设计引物，重新在陆地棉叶片cDNA中进行克隆。使用Gene Structure Display Server软件分析GhNAC7结构，使用在线工具PlantCARE分析启动子序列，利用在线工具GenScan进行氨基酸序列翻译。同时，利用拟南芥基因组数据库（TAIR）进行序列比对，选取得分较高的NAC家族基因，使用MEGA 6.06软件和GeneDoc软件进行进化树分析和氨基酸比对。以XbaⅠ和SacⅠ为酶切位点构建35S::GhNAC7-GFP融合表达载体，分析其在洋葱表皮细胞中的瞬时表达，进行亚细胞定位。利用实时荧光定量PCR技术分析GhNAC7在棉花不同组织、不同叶片发育时期以及在200 μmol·L-1 ABA调控下的表达量。通过构建pGhNAC7-GUS融合表达载体并转拟南芥，分析其启动子特异性。以EcoRⅠ和SalⅠ为酶切位点，利用pBI101和pBI121载体，分别构建融合表达载体并转拟南芥进行过表达分析。【结果】从陆地棉中成功克隆GhNAC7，其全长为1 064 bp，包含3个外显子，2个内含子。生物信息学分析结果表明，GhNAC7开放阅读框为834 bp，可编码277个氨基酸，其蛋白质分子量为31.35 kD，等电点为9.22。结构域分析表明其属于NAC转录因子的NAM亚家族，进化树分析显示GhNAC7与ANAC041、ANAC083同源性最高，其中，GhNAC7与ANAC083结构域位置均为17—58 aa。其启动子核心元件包含一系列与衰老、激素、胁迫相关的顺式作用元件。亚细胞定位表明其蛋白为核蛋白。组织特异性表明GhNAC7在真叶、子叶、花、花药和衰老真叶中均明显表达，其中在衰老的真叶中表达量最高。启动子特异性分析表明，其GUS活性在衰老的叶片中最强。在拟南芥中过表达该基因，转基因植株比野生型表现出明显的衰老症状。荧光定量PCR分析表明，ABA处理后6 h GhNAC7明显上调表达，并在48 h表达量达到最高，这表明ABA可调控GhNAC7表达从而调节棉花叶片衰老。【结论】GhNAC7可以促进棉花叶片衰老并受ABA的调控。 关键词：陆地棉；NAM结构域；叶片衰老；GhNAC7；过表达 Molecular Cloning and Functional Analysis of GhNAC7 in Upland Cotton (Gossypium hirsutum L.) ZHENG XueWei1,2, SHAH Syed Tariq2, FAN ShuLi2, WEI HengLing2, PANG ChaoYou2, LI HongBin1, YU ShuXun2 (1College of Life Science, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang; 2 Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan) Abstract:【Objective】The primary objectives of this experiment are to clone GhNAC7 gene, analyze its structure, detect its expression in differ