Ⅱ组代谢型谷氨酸受体阻断剂对老年痴呆大鼠模型脑内nNOS及nNOS mRNA表达的影响.docVIP

　　Ⅱ组代谢型谷氨酸受体阻断剂对老年痴呆大鼠模型脑内nNOS及nNOS mRNA表达的影响 作者：冯荣芳 刘凌云 石卫东 李娜 冯亚青 【摘要】 目的 阐明Ⅱ组代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor 2/3，mGluR2/3）对老年性痴呆（AD）发病过程中一氧化氮（NO）的影响。方法 应用免疫组化和原位杂交方法，观察脑室应用Ⅱ组mGluR2/3阻断剂α甲基(4四唑基苯)甘氨酸 (MTPG)对脑室β淀粉样肽（Aβ）注射所致的AD大鼠神经型一氧化氮合酶（nNOS）及其mRNA表达的影响。48只SD大鼠随机分为假手术组、痴呆组、痴呆组+MTPG组，每组16只。各组大鼠均在Morris水迷宫测试后常温饲养1 GluR2/3阻断剂MTPG，可部分阻断AD引起的nNOS表达增加，对神经元的形态也有恢复作用。原位杂交与免疫组化显示相似的变化趋势。结论 mGluR2/3参与AD发病过程，NO信号通路可能发挥重要作用。 【关键词】 脑室Aβ注射；神经型一氧化氮???酶； 代谢型谷氨酸受体；α甲基(4四唑基苯)甘氨酸;SD大鼠 代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)是脑内广泛存在的、与G蛋白偶联的膜受体，参与脑内许多生理、病理过程。研究证实， mGluRs参与脑缺血耐受的发病机制〔1〕，并在老年性痴呆(AD)的发病中起一定作用。一氧化氮 (NO) 作为非经典神经介质参与许多与谷氨酸受体激活相关的生理、病理过程〔2〕，如海马的长时程突触传递增强和小脑的长时程突触传递抑制、神经递质释放的调节、动物的学习和记忆〔3〕以及缺血耐受过程等〔4〕。本实验采用免疫组织化学和原位杂交方法，观察脑室应用Ⅱ组mGluR阻断剂α甲基(4四唑基苯)甘氨酸(MTPG)对AD发病过程中NO的影响。 　 　1 材料与方法 　　1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠48只，体重250～280 g（由河北医科大学实验动物中心提供)，随机分为假手术组、痴呆组和痴呆+MTPG组，每组16只。①假手术组：进行所有手术操作,注射等量蒸馏水。②痴呆组：于大鼠左侧脑室缓慢注入凝聚态β淀粉样肽（Aβ2535） （浓度为4 g/L）5 μl；③痴呆+MTPG组：大鼠左侧脑室注入A β25～35后1 g(MTPG溶于人工脑脊液)，其他两组均右侧脑室注入等量人工脑脊液。4 g/kg)腹腔麻醉下，固定于江湾1型C大鼠立体定位仪上，常规消毒，切皮，暴露前囟，依据大鼠脑立体定位图谱，于前囟后0.8 mm，中线左旁开1.5 mm，用牙科钻开颅，切开硬膜，用微量进样器自脑表面垂直进针4.0 mm (AP：-0.8 mm，ML：1.5 mm，DL：4.0 mm)，于左侧脑室缓慢注入凝聚态Aβ25～35 5 μl，留针5 min，缓慢撤针；对照组动物经历同样的手术程序，注射等量蒸馏水。关闭切口，待动物清醒后，送回养笼，自由饮水，饮食。MTPG右侧脑室注射：方法同上，在AD建模后1 m，中线右旁开1.5 mm)，用牙科钻开颅，切开硬膜，用微量进样器自脑表面垂直进针4.0 mm (AP:-0.8 mm，ML:1.5 mm，DL:4.0 mm)，注射MTPG(4 mg/ml，溶于人工脑脊液)，每次注射MTPG 10 μl，1 min内注完，留针5 min；其他两组动物经历同样的手术过程，分别注射等体积的人工脑脊液；注射4 ,并加入适量奶粉使水浑浊,水温控制于（20±2）℃。实验前1 d将大鼠放入不含平台的水槽中2 min,使其适应迷宫环境及游泳。试验共7 d。前6 d进行定向航行试验将大鼠从入水点置入水槽中，记录60 s内大鼠从入水到爬上平台所需时间即潜伏期。每只大鼠每天训练4次,即从4个不同象限入水点入水进行训练各1次。训练中，若大鼠在60 s内找到平台,让其于平台上站立10 s；若未找到，用棒将其引上平台,并让其站立10 s,潜伏期记为60 s。第 7天进行空间探索试验：撤去平台，将大鼠从第二象限入水点放入水槽，记录60 s内其在平台象限(第三象限)的滞留时间。 　　1.4 脑组织病理学检测 在预定取材时间点，将动物戊巴比妥钠深麻醉后，开胸经升主动脉依次灌注4℃生理盐水100 ml，4℃40 g/L多聚甲醛250 ml（10 min快速阶段，50 min慢速阶段）后，取出大脑。冠状切取视交叉后1～4 mm脑组织，用40 g/L多聚甲醛固定2～4 h，常规脱水，石蜡包埋。在背侧海马水平连续切片，片厚6 μm，展片、脱蜡后，硫堇染色下观察海马CA1区迟发性神经元死亡(DND)情况。在光学显微镜下对海马CA1区组织学改变进行分级(Histological grade，