RNA提取步骤Word文档.doc

RNA提取：用TaKaRa RNAiso Reagent试剂提取RNA步骤 2007-12-10 13:52 试验前准备的物品(1).试剂盒之外所需准备试剂：◆?? 氯仿 ◆?? 异丙醇 ◆?? 75%乙醇（DEPC 处理水配制） ◆?? RNase-free 水（制备方法：使用 RNase-free 的玻璃瓶，向超纯水中加入 DEPC 至终浓度 0.01%（v/v），过夜搅拌后，高温高压灭菌。 (2).尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 a） 用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃下处理 12 小时。 b） 然后在 120℃下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 DEPC。 RNA 实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。 (3) 用于 RNA 实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60 分钟）或使用上述方法进行 DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可以使用 RNA 实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理后再进行高温高压灭菌?? RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。 实验操作1.?? RNAiso Reagent 的使用量情况如下。 2.?? 实验样品的研磨和匀浆。 A. 贴壁培养细胞 ①?? 倒出培养液，用 1×PBS 清洗一次。 ②?? 每10 cm2生长的培养细胞中加入 2 ml的RNAiso Reagent，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于 ????? 细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥 ????? 离细胞）。 ③?? 将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 ④?? 室温静置 5 分钟。 B. 悬浮培养细胞 ①?? 将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4℃离心 2 分钟，弃上清。?? ②?? 向每 5×106个细胞中加入l ml的RNAiso Reagent。 ③?? 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 ④?? 室温静置 5 分钟。 C. 动物组织、植物材料样品 ①?? 将超低温冻结的 RNA 提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响 RNA 的收率和质量）。 ②?? 对于普通的 RNA 提取样品，可以向研钵中加入适量的 RNAiso Reagent，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 ????? 对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的 RNAiso Reagent 的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。 ③?? 将匀浆液转移至离心管中，室温静置 5 分钟。 ④?? 12,000 g 4℃离心 5 分钟。 ⑤?? 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。???3.?? 总 RNA 的提取。 ①?? 向上述步骤 2 的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Reagent 的 1/5 体积量），盖紧离心管盖，用力震荡（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待充分乳化溶液呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置 5 分钟。?? ②?? 12,000 g 4℃离心 15 分钟。 ③?? 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 ④?? 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在 15～30℃下静置 10 分钟。 ⑤?? 12,000 g 4℃离心 10 分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。 4.?? RNA 沉淀的清洗。 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入 75％的乙醇 l ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心 5 分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制 RNA 中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。 5.?? RNA 的溶解。 室温干燥沉淀 2～5 分钟（不可以离心或加热干燥，否则 RNA 将会很难溶解，有关 RNA 溶解可以参考Troubleshooting 中的相关说明），加入适量的 RNase-free 水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待 RNA 沉淀完全溶解后于-80℃保存。 流程图