透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的影响.docVIP

　　透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的影响 .L.编辑。 作者：吴益民 王洪军 孙艳 吴琼 冯立 张志强 杨青 杨国平 【摘要】 目的 利用已含有血红蛋白基因(vgb)的红色糖多孢基因工程重组菌，探讨vgb表达产物对重组糖多孢红霉菌提高红霉素产率的影响。方法 用SDS、ethod A vgb gene osomal DNA of Sac.erythraea by electrotransformation and the rebinant Sac.erythraea ethod. Glucose concentrations and total protEin content in original Sac.erythraea and rebinant strain fermentation processes ined and pared ical assay. The erythromycin titers ethod. Results At the second stage of fermentation, glucose concentration of original strain reached 0.4g/L at about 38h and that of rebinant strain ycin in original strain and rebinant ycin production of rebinant ycin production and shoog-lobin gene，vgb)本实验室构建。红霉素生物检测的检定菌和藤黄微球菌(Micrococus luteus)28001购自大连医药公司。 (2)试剂 红霉素标准品购自Fluka公司。葡萄糖、正丙醇、糊精、培养基与常用化学试剂和免疫试剂均购自上海生物工程公司。 (3)仪器及设备 日本SANYO MS-3020型高压灭菌锅；美国Beckman J2-21型低温离心机；瑞士INFORS公司生产的Minifors实验室小型发酵罐和Techfors-S中试型发酵罐；宁波新芝科仪器研究所生产的超声波细胞粉碎仪；惠普上海分析仪器有限公司生产的7320分光光度计。 1.2 方法 (1)重组红色糖多孢菌载体的构建与工程菌株的筛选 见 2 结果 2.1 透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌中表达 取重组糖多孢红霉菌发酵培养物裂解液40μl，经SDS检测，重组红色糖多孢菌株在15.9ku处有一条特征性的蛋白泳带，而原始对照菌株则没有(图1)。 2.2 发酵过程中游离葡萄糖的浓度的比较 从图2中可以看出红色糖多孢菌原始菌株和重组菌株在发酵过程中游离葡萄糖的浓度存在差异。原始菌株在3个时段检测出了游离葡萄糖，第1时段是接种后12h内，游离葡萄糖浓度达到约1.1g/L；第2时段是38h左右，糊精补料已经开始；第3个时段96h左右是糊精补料结束。原始菌株第2时段游离葡萄糖浓度较高，达到0.4g/L，而重组菌株只有0.25g/L；原始菌株出现了第3时段游离葡萄糖浓度高峰， 而重组菌1：分子量标记物； 2：原始菌株； 3：重组菌株株却没有。 2.3 发酵过程中总蛋白浓度的比较 红色糖多孢菌的原始菌株与重组菌株发酵液中生物物质浓度［以总蛋白(g/L)表示］存在着不同，见图3与表1。重组菌株比原始菌株约低27%，说明重组菌株的生长率较低。 2.4 发酵过程中红霉素的效价比较 本实验比较了在发酵过程中3批红色糖多孢菌原始菌株与重组菌株产生红霉素的平均效价曲线，原始菌株与重组菌株的最终红霉素效价分别为3.98和5.15g/L，即重组菌株提高红霉素体积产率约29%，这种提高是生物合成速率增加的结果。 计算 48～144h红霉素产率，重组菌株为36.5mg/(L·h)，原始菌株24.3mg/(L·h)。重组菌株红霉素效价较高，生物物质浓度低24%～50%，使重组菌株的红霉素比产率高出原始菌株约1倍，见图4与表1。 3 讨论 工业 生产上，重组菌株红霉素的产量及其遗传稳定性是至关重要的。本项实验采用类似的工业生产过程进行发酵罐实验，结果表明，重组菌株产红霉素的最终效价比原始菌株提高29%， 重组菌株的高产率加上表1 红色糖多孢菌原始菌株和重组菌株的生物量（略 ） 持续的高效价对于提高整个发酵过程的日产率具有重要意义。例如，重组菌株在144h时的红霉素产率达到0.68g/(L·d)，而原始菌株在192h的产率仅为0.49g/(L·d)，前者的产率高出后者40%。原始菌株游离葡萄糖浓度高峰的出现与红霉素产率下降也呈现相一致的情况，重组菌株在消耗葡萄糖量增加的情况下，总蛋白浓度显著减少，使红霉素产量增加了29%，说明重组菌株比原