健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定.docVIP

　　健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定 作者：甘宜敏，孔凡运，史震，汤仁仙，郑葵阳 【摘要】 目的 克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G(apolipoprotEin B mRNA editing enzyme，catalytic polypeptide 3G，APOBEC3G)基因cDNA，构建APOBEC3G基因的真核表达载体，并在体外进行表达和鉴定。方法 采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因，将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体，构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒，并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞，经免疫细胞化学、ethods The coding region of APOBEC3G gene plified by RT-PCR from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy humans, and then the gene fragment id of pcDNA3.1-A3G, munocytochemistry and 等)内的复制，成为近年来逆转录病毒研究领域的一项重大进展。HBV虽不属于逆转录病毒，但其有一个与HIV类似的逆转录复制过程。有研究表明APOBEC3G可抑制HBV复制[2-3]，但具体机制不明确。本实验从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因，并构建该基因的真核表达载体，为后续研究APOBEC3G抑制HBV复制的作用机制奠定实验基础。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 质粒、细胞株 pcDNA3.1质粒、HepG2细胞和HL7702细胞由本室保存。 　　1.1.2 主要试剂及引物 RPMI-1640培养粉、Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，PCR试剂盒(Promega公司)，限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ(Takara公司)，兔抗人APOBEC3G多克隆抗体(AVIVA公司)，PCR引物及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 　　1.1.3 仪器 CO2恒温培养箱、高速冷冻离心机、PCR扩增仪、Biophotometer生物分光光度计(Eppendorf公司)，凝胶成像系统(BIO-RAD公司)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 APOBEC3G的克隆、真核表达载体构建及鉴定 抽取健康人外周血，分离收集单个核细胞(PBMCs)，Trizol法提取RNA。RT-PCR扩增获得约1.2 kb大小的含APOBEC3G全基因编码序列的DNA片段。逆转录反应体系为25 μl，混匀后置42℃孵育1 h。以逆转录产物2 μl为模板进行PCR扩增。上游引物序列：5′-CCCAAGCTTATGAAGCCTCACTTCAGAAAC-3′，下游引物序列：5′-CCGGAATTCTCAGTTTTCCTGATTCTGGAG-3′。上、下游引物序列5′端分别带有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点。PCR循环参数：95℃ 5 min预变性;随后95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，共35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物纯化后用HindⅢ和EcoRⅠ酶切、回收并连接到pcDNA3.1载体上，转化、扩增、筛选并经酶切鉴定，获得APOBEC3G真核表达质粒pcDNA3.1-A3G，并经测序确证。 　　1.2.2 RT-PCR鉴定APOBEC3G的真核表达 人肝癌细胞HepG2用含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液常规培养。人正常肝细胞HL7702用含20%小牛血清,其他成分同HepG2细胞的培养液培养。接种6孔板后，用Lipofectamin 2000分别将质粒pcDNA3.1、pcDNA3.1-A3G转染HepG2细胞，以未转染细胞做空白对照，同法转染HL7702细胞，操作按试剂说明书进行。转染72 h后收集细胞，提取总RNA，进行RT-PCR。 　　1.2.3 免疫细胞化学鉴定APOBEC3G的真核表达 细胞常规培养，接种24孔板后，转染方法同上，操作按试剂说明书进行。转染72 h后，PBS洗涤细胞，免疫细胞化学法检测转染细胞胞质中目的蛋白：经4%多聚甲醛固定和0.1%TritonX-100通透细胞膜后，依次加入一抗和二抗，加NBT/BCIP显色液显色后于光镜下观察,并照相。 　　1.2.4 Western blot鉴定APOBEC3G真核表达 细胞常规在培养瓶中培养，转染方法同上，操作按试剂说明书进行。转染72 h后收集细胞蛋白，进行SDS电泳和蛋白印迹分析鉴