干扰素制备的工.pptVIP

3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃，pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。 4. 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。 * 干扰素发酵过程控制 在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5小时开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到最大，然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单孢杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策略进行过程控制。 * (1)．溶解氧控制 分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以期提高干扰素的发酵水平。通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。 (2). 温度控制 假单孢杆菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。产物合成温度控制在20℃可以有效防止干扰素-α2b的降解，而其最佳生长温度则为30℃。质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降，因此在培养后期降温可以减少目标产物的降解，增加质粒的稳定性。 (3)．pH值 发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件所决定。干扰素-α的等电点在pH 6.0附近，在低酸性条件下稳定，能耐受pH 2.5的酸性环境。因此可在发酵后期降低pH，从而造成大量蛋白酶失活，减少干扰素-α的水解，提高干扰素的积累量。 * 半成品检定 （1）效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。 （2）蛋白质含量测定 福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。 （3）比活性 效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。 （4）纯度 电泳纯度用非还原型SDS法，银染显色应为单一区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。 * （5）相对分子量测定 还原型SDS，加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。 （6）残余外源性DNA含量测定 用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。 （7）残余血清IgG含量测定 在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。 （8）残余抗生素活性测定 半成品中不应有抗生素活性存在。 * （9）紫外光谱扫描 检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳米。 （10）肽图测定 用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。 （11）等电点测定 等电聚焦电泳。 （12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质试验。 * 成品检定 （1）物理性状 冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得含有肉眼可见不溶物。 （2）鉴别试验 应用ELISA或中和试验检定。 （3）水分测定 用卡氏法，应低于3%。 （4）无菌试验 同半成品。 * （5）热原质试验 同半成品检定。 （6）干扰素效价测定 同半成品检定，效价不应低于标示量。 （7）安全试验 取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。 取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存活，说明成品合格。 * 1.目的基因的获取为什么用mRNA而不是DNA？ 基因组，即某种生物一个细胞内全部的DNA信息。 将这些DNA打断，连接到载体上并转入微生物，使这些微生物细胞内含有某生物的全部基因组。那么这些微生物就组成了基因组文库。 以上两者包含的都是遗传信息。对于某种生物来说，任何一个细胞的遗传信息都是相同的。 cDNA是由细胞内的mRNA通过逆转录的方式获得的，其包含的一个细胞内的表达信息。多细胞生物