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农杆菌介导的玉米芽尖和愈伤组织的遗传转化 获得转化植株 PCR检测 AAFA阳性植株 UFB阳性植株 UPFA阳性植株 有性杂交 自交 有性杂交 AT1 FT1 PT1 PCR检测 PCR检测 去除选择标记基因的 去除选择标记基因的 阳性植株进行Southern 阳性植株进行Southern Northern blot检测 Northern blot检测 * 去除选择标记基因的基因聚合玉米植株的获得： 在获得去除选择标记 基因的转单基因的阳性 植株基础上，使带有单 基因的植株之间进行有 性杂交，筛选后代以获 得基因聚合的阳性植株； AT1阳性植株 x PT1阳性植株 APT2 PCR检测 对去除选择标记基因而 含有两种目的基因的 阳性植株进行Southern Northern blot 检测 * 在得到转单基因的阳性植株基础之上，进行二次转化或者有性杂交，对其后代进行分子生物学检测，得到含有两个目的基因的阳性植株，将其与含有FLP重组酶的阳性植株进行有性杂交，经过检测可以得到去除选择标记基因的基因聚合植株； * AAFA阳性植株 x UPFA阳性植株 APT1 PCR检测 含有两种目的基因的阳性植株 Southern Northern blot 检测 PCR检测 对去除选择标记基因而 含有两种目的基因的阳性植株进行 Southern Northern blot 检测 x FT1 * 在获得去除选择标记基因的转单基因的阳性植株后，利用二次转化或有性杂交的方法将第二个目的基因(其选择标记基因的两侧带有同向的frt位点)导入，在原阳性植株中的FLP重组酶的作用下将带有第二个目的基因的表达载体中的选择标记基因去除，同时实现目的基因的聚合。 PT1阳性植株 x AAFA阳性植株 (AT1阳性植株) (UPFA阳性植株) APT2 PCR检测 对去除选择标记基因而含有两种目的基因的阳性植株进行Southern Northern blot 检测 * 构建植物表达载体: pCAMBIA1300-hsp-flp-bar 转化玉米芽尖及愈伤组织，成苗后经分子生物学检测得到转基因阳性植株，通过在不同时期，不同温度条件下对植株的不同部位进行热激，诱导由热诱导启动子启动的重组酶FLP的表达，检测该酶的表达水平，以确定诱导重组酶表达的最佳条件。 * 探索重组酶作用位点frt的长度及串联个数对重 组效率的影响： 构建不同长度的位点序列的两串联重复和三串 联重复： frt1:78bp frt2:78bp frt1:96bp frt2:96bp frt1:117bp frt2:144bp 将这些成对的位点序列置于需要删除的基因两侧，重组质粒后转入E.coli，提取质粒鉴定后，将质粒与纯化的FLP重组酶共同孵育，检测重组事件是否发生。 * 一点设想： 在获得去除选择标记基因的转单基因的阳性 植株A基础上，构建带有不同目的基因的植物表达载体B，使B仅在目的基因的一侧带有单一frt位点，然后用植物表达载体B对A进行二次转化，期