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PI staining RFP+ T cells RFP- T cells Without stimulation PMA + Ionomycin IL-2 IL-4 IFN-r * * * * * * 1 2 3 4 Longpass(LP) Shortpass(SP) Bandpass(BP) 460 500 540 460 500 540 460 500 540 SP 500 LP 500 BP 500/50 检测器组 （激光器） PMT位置 带通/长通透镜 适用染料 488nm蓝色激光 FL1 530/30 FITC FL2 585/42 PE, PI FL3 670 LP PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7 635nm红色激光 FL4 661/16 APC 空白对照（unstained cell ）: 消除自发荧光的干扰 * 自发荧光：即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强 单色荧光染色（single color staining）：特异荧光染色和非特异荧光染色 * 特异荧光：抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光； * 非特异荧光：即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光。 NRS block or FcγR inhibitor 同型对照（Isotype Control） 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 （即Fc段相同， F(ab’)2段不同） 与染色的单克隆抗体 ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色 例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（γ1）和IgG2a（ γ2a），并分别标记FITC和PE APC FITC 荧光补偿（compensation）：是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和/或其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行细胞染色 分析类型 管 功能 加入的抗体 双色分析 1 Isotype γ1-FITC γ2a-PE 2 Compensation1 A-FITC γ2a-PE 3 Compensation2 γ1-FITC B-PE 4 Sample1,2…… A-FITC B-PE No. Antibody Isotype Mouse anti-human 未免疫Mouse 血清纯化而来 1 A-FITC（γ1） γ1-FITC 2 B-PE（γ2a） γ2a-PE BD FACS AriaII FACSDiva software Setting High Medium Low Frequency (kHZ) 87 60 30 Attenuation off on On Gap 6 6 10-12 Drop1 4th drop 3rd drop 3rd drop Purity Continuous Pre sort gating and hierarchy Spleen +LN Pre-sorted CD4+ CD44 CD62L After-sorted memory T After-sorted naive T CD4+7AAD- CD4 200 400 600 800 1000 G0/G1 s G2/M DNA分析 DNA含量 细胞数量 2N 4N * * * * * *