痰瘀证的血清蛋白质指纹图谱的临床研究.docVIP

　　痰瘀证的血清蛋白质指纹图谱的临床研究 【摘要】 ［目的］分析痰瘀证患者血清蛋白质指纹图谱，探讨痰瘀证患者血清多肽蛋白表达的差异性。［方法］应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDITOFMS）及弱阳离子交换蛋白质芯片（ albumin fingerprint spectrum of sputum stasis syndrome and explore the disparity of its polypeptide albumin expressions.［Method］Apply SELDITOFMS and al persons’ serum for fingerprint spectrum.［Result］There’re 18 kinds of disparity albumin betal persons.［Conclusion］Sputum stasis patients have some different expressed albumin in serum. 　　Key stasis syndrome；albumin；fingerprint spectrum 所谓“证”，是指在疾病 发展 过程中，某一阶段的病理概括。它包括病的原因（如风寒、瘀血、痰饮等等）、病的部位（如表、里、某脏、某腑等等）、病的性质（如寒、热等等），反映了疾病过程中该阶段病理变化的全面情况。笔者应用SELDITOFMS及蛋白质芯片技术从蛋白质指纹图谱角度探讨痰瘀证本质及发病机制。 　 　1 资料与方法 　　1.1 临床资料 　　14例为2008年1月至2008年12月浙江省人民 医院 中医科门诊病人，诊断标准根据《中医诊断学》中关于痰证和瘀证的诊断标准拟定，主要以舌象的舌质紫暗、舌苔滑腻和脉象的脉涩为诊断依据。其中男13 例，女1例；年龄25～69 岁，平均（47）岁。选择16例正常健康人为对照组，其中男15例，女1例；年龄28～65岁，平均（46.5）岁。2组年龄、性别等资料经统计学处理无显著性差异，具有可比性。 　　1.２ 材料和方法 　　（1）材料：尿素、乙腈、三氟乙酸、TrisHCl pH9.0、CHAPS、DTT、NaAc、HPLC H2O 和sinapinic acid（SPA）等均购自Sigma公司。（2）方法：①血清标本处理：14例痰瘀证患者和16例正常健康人各空腹采集静脉血3ml，采集后立即于4℃低温冰箱静置2h， 4℃，4000r/min离心10min分离血清，将血清于4℃，12000r/min再次离心5min，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为每管100μl，保存于-80℃冰箱。实验检测血清均仅一次冻融。从-80℃冰箱中取出血清样品，于4℃，10000 r/min，离心5min；取血清10μl，加入20μlU9缓冲液（9M Urea，2% CHAPS，50mM TrisHCl，pH9.0）稀释，而后，将以上标本冰浴振荡30min，400r/min；将30μl上述变性后标本加入360μl相应的结合缓冲液混匀，待用。所有样本均进行双份检测以减少实验误差。② NaAc，Ph4.0）加至已装好S1 Minishaker）400～600 r/min震荡 5min，甩掉缓冲液。重复上述操作两次。在芯片处理器每孔中加入100μl处理好的标本，置振荡器400～600 r/min，4℃震荡1h；甩出标本。 每孔加入200μl结合缓冲液，室温置振荡器400～600 r/min，震荡 5min，甩去孔中液体，再次加入结合缓冲液200μl，重复操作一次。立刻拆开芯片处理器，取出芯片，待干后，在每个加样孔上加SPA0.5μl，干燥后再重复加SPA0.5μl一次，然后用蛋白质指纹图谱仪（SELDITOFMS，美国Ciphergen公司）阅读芯片。③蛋白质指纹图谱的测定参数和标化：在读取数据前，用加有allinone标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，使分子误差lt;0.1%。本研究中阅读仪的主要参数设定：最佳激光强度240，最佳检测灵敏度8；设最高检测分子质量为50Da，最佳状态从1Da到15000 Da；蛋白质指纹图谱的标化参数：蛋白峰范围质荷比（m/z）2000～45000；m/z为6634.8的蛋白为所有蛋白谱的共有蛋白，作为校正的内参照。 　　1.３ 统计学处理 　　蛋白质指纹图谱统计用Ciphergen Protein Chip软件，数据输入 计算 机，两样本总体方差齐同时，两样本均数用t检验； 两样本总体方差不齐同时，两样本均数用近似t检验，以Plt;0.05为差异有统计学意义。 　 　2 实验结果 14例痰瘀证患者血清蛋白质指纹图谱建立后，在（m/z）200