抗谷胱甘肽-S-转移酶(GST)单克隆抗体的研制及初步应用.pdfVIP

• c , • 4 期 83 A8RICULTURAE 滕 蔓等:抗谷脱甘肤-s-转移酶 (GST) 单克隆抗体的研制及初步应用 88REAU-Slnl凶 后 20 d 腹腔和尾静脉分别注射不加佐剂的 GST 各 鼠由河南省动物免疫学重点实验室自繁，NSO 细胞 由英国国家动物健康研究院惠赠，弗氏完全佐剂 30 问，3 d 后取小鼠脾细胞供细胞融合。 (FCA) 、弗氏不完全佐剂(FIA) 等化学试剂均为Sig­ 1. 2. 3 杂交瘤细胞的融合 按常规方法融合[町， ma 公司产品，辣根过氧化物酶( HRP) 标记羊抗鼠 取 NSO 细胞与免疫鼠脾细胞以个数比 1:10 混合，用 IgG 由河南省动物免疫学重点实验室制备，商品化 PEG-1500 作为融合剂，接种于4 块 96 孔培养板中， GST 单抗购自碧云天生物技术研究所，细胞培养液 每孔 1640/HAT 培养液 200μL ， 5% CO 培养箱中 2 4 RPMI-1640 、筛选培养基 HAT、 HT 均购自 GIBCO 公 培养，在融合后第 天半量换 1640/HAT 培养液、第 司，PEG-1500 购自罗民公司，胎牛血清购自杭州四 7 -10 天抽取细胞上清检测。首先用棋盘方阵滴定 季青公司。 法确立最佳 GST 蛋白抗原包被量。 1.2 方法 1. 2. 4 阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆 以 1. 2.1 免疫原的制备 GST 蛋白作为抗原，用间接 ELlSA 法[4J 检测 96 孔 1. 2. 1. 1 GST 的诱导表达及重组菌的裂解 挑取 板上杂交瘤细胞培养上清，得到抗 GST 阳性的杂交 单个载体菌 pGEX-6P-l 菌落，接种于 10 mL 2 x YT 瘤细胞，将其转到 24 孔板上继续生长，待 24 孔板长 培养基中，37t:振荡培养， 12 町 15 h 后取出 1 mL 培 满后再次抽取上清进行检测，选取 2 -3 孔强阳性 养物接种于 100 mL 的 2 xYT 培养基中。 37 t:摇振 孔，按有限稀释法进行亚克隆，杂交瘤细胞株一般进 培养约 3 h 后按照每毫升培养基加入 10μL 100 行 2 -3 次亚克隆，末次克隆后筛选出状态良好、生 mmollL 的 IPTG ，使 I阿G 终浓度为 1.0 mmoνL，在 长旺盛的强阳