犬瘟热——犬冠状病毒双重PCR诊断方法的建立及初步应用.pdfVIP

• 99 • 生物技术 中国畜牧兽医 2014 年第 41 卷第 3 期 犬瘟热一犬冠状病毒双重 PCR 诊断方法的 建立及初步应用 孙园园，赵鹏，刘骏，王云，钱科 (镇江出入境检验检疫局，江苏镇江 212008) 摘要:为更好的开展犬腹泻病的诊断与疫情监控，根据犬瘟热病毒(canine distemper virus. CDV) 和犬冠状病毒(canine coronavirus. CCV) 的基因特征，建立了可快速鉴别诊断 CDV 和 CCV 的双重 PCR 方法。对 GenBank 中登录的 21 株 CDV 和 17 株 CCV 的野毒株、疫苗株基因组全序列进行比对分析，分别针对 H 蛋白和 S 蛋白编码区各设计了 1 对特异引物，分别扩增 出大小为 550 和 225 bp 的目的片段。回收目的片段插入到 pMD18-T 载体中进行测序鉴定，分别提取阳性质粒制备阳性标准 DNA。通过优化试验条件，建立了检测 CDV 和 CCV 的双重 PCR 方法并对其进行灵敏度、特异性和临床验证。该双重 PCR 方法能特异的扩增 CDV 和 CCV.且敏感性均达到 O. 1 ng/μL 总核酸量。与胶体金试纸条方法对比检测 67 份临床样品，符合 率较高.CDV 达到 92.5% .CCV 达到 94% 。 关键词:犬瘟热病毒E 犬冠状病毒;双重 PCR 中图分类号:Q78 文章编号:1671-7236(2014)03-0099-04 文献标识码:A 犬瘟热病毒(canine distemper virus , CDV) 与 参考。 犬冠状病毒(canine coronavirus , CCV) 是 2 种严重 1 材料与方法 1. 1 材料 危害养犬业、经济动物养殖业和野生动物保护的病 毒性传染病病源(程悦宁等，2013; 孙园园等，2009) 。 1. 1. 1 毒株和样品 犬瘟热病毒 CDV3 株、CCV 阳性样品、Vero 细胞均由山东省滨州畜牧兽医研究 在临床上常发生 CDV 与 CCV 的混合感染，使临床 症状复杂化，给疾病的诊断带来困难 (Soma 等， 院惠赠。疫苗样品(含 CDV、犬细小病毒、犬腺病毒 2 型、犬副流感病毒)购自富道公司。试验样品为 2011) 。目前临床上对 CDV 和 CCV 的诊断主要依 2011 年至 2012 年采自山东多个兽医门诊的 67 份 靠传统的病原学和血清学诊断方法，病毒的分离培 发生腹泻的病犬粪便、肠内容物等。 养和电镜观察特异性较强，但耗时长、需专业仪器、 不适于快速诊断和基层应用(李天松等，2012; Cha 1. 1. 2 试剂 AxyPrep 体液病毒 RNA 提取试剂 盒购自爱思进生物技术有限公司;反转录酶 M­ 等，2012) 。血清学检测方法相对简便，但机体感染 MLV、 dNTPs， rTaq DNA 聚合酶、大肠杆菌 DH5a 病毒后需潜伏一定时期才能出现病毒血症，不利于 感受态细胞、限制性核酸内切酶、RNA 酶抑制剂等 早期诊断。因此，建立一种快速、简捷、准确且能同