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蛋白纯化培训总结 蛋白质分离纯化一般需经过细胞破碎、澄清、分离等步骤。 1 细胞破碎 常见的细胞破碎方法有超声破碎法、反复冻融法、高压匀浆法、珠磨破碎法等。实验中应根据实验室现有实验条件来选择合适的破碎方法。冻融法操作十分简便，无需特殊设备，在实验室中使用很方便，但耗时，耗能，大规模应用困难。珠磨破碎法适用范围较广，但对操作者的经验水平要求较高，且制备量不易放大。本实验室主要采用高压匀浆法破碎细胞，一方面可以得到充分破碎的细胞，高压匀浆机的制冷系统也可减少蛋白质的热变性的可能，另一方面此种方法与其他方法相比，可在增大细胞破碎量的时候有效的节约时间。若不具备高压匀浆破碎细胞的条件，也可采用超声破碎法，但超声破碎的效率受到声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等多种因素的影响。 2 澄清 经过细胞破碎的蛋白样品中含有大量的细胞碎片，不利于此后纯化过程的进行，需对样品液进行澄清处理。这一过程可通过离心、过滤、微滤等方法进行。实验室较多采用离心的方法获取澄清的液体，也可使用微滤的方法，如使用膜孔大小低于0.45μm的滤膜进行过滤，但容易出现频繁的滤膜堵塞的状况，需多次更换滤膜。大规模生产中可使用过滤的方法，如板框过滤法。 3 分离 分离的方法主要有沉淀法、超速离心、超滤、层析。沉淀法在血液制品的生产中应用较多，如沿用至今的冷乙醇沉淀法制备血浆蛋白。超速离心法根据不同大分子物质沉降系数的不同，通过离心将其分离开来，如用于病毒颗粒的分离。超滤法分离效率不高，主要应用于样品的浓缩。层析法在蛋白纯化中应用最为广泛，主要包含了离子交换层析、反相层析、疏水相互作用层析、亲和层析、体积排阻层析。 3.1 层析 在以上几种层析方法中，应用较多的为离子交换层析和亲和层析。 离子交换层析根据蛋白质与介质之间静电吸附的强弱进行分离。实验中应用离子交换层析时，需要根据纯化对象的不同，在离子交换层析介质、洗脱液pH值、缓冲溶液类型、洗脱盐类型这几方面进行预实验，以寻找出最适的条件，预实验可用重力柱进行。 离子交换层析分为阳离子交换层析和阴离子交换层析，两种类型离子交换剂的常用电荷基团如下表： 阴离子交换剂 阳离子交换剂 Diethylaminoethyl(DEAE) 二乙氨乙基 -CH2CH2N+(CH2CH3)2 Carboxymethyl (CM) 羧甲基 -CH2COO– Quaternary aminoethyl(QAE) 季铵基乙基-CH2CH2N+(C2H5)2CH2CHOHCH3 Sulphopropyl (SP) -CH2CH2CH2SO3– Quaternary ammonium (Q) 季铵盐-CH2N+ (CH3)3 Methylsulphonate (S) -CH2SO3– 亲和层析则是通过生物特异性差异分离样品的液相层析技术。可分离其他层析方法难以分离的样品。此种方法需根据纯化的物质不同选择不同的配基。在我们的实验中，选择了将目的蛋白与组氨酸标签融合表达，运用组氨酸标签与层析柱上金属离子（Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+）的特异结合，来分离纯化目的蛋白。 层析技术的基本步骤包含平衡、上样、洗脱，需根据纯化对象的不同，来探索优化洗脱方案。线性梯度洗脱虽为标准方法，且精确度高，但阶梯洗脱方法往往有更好的效果，实验中需摸索不同洗脱浓度下的洗脱体积，以确定针对特定蛋白样品的最佳方案。如果单一一种层析方法的纯化效果不佳，可尝试采用多种层析方法进行纯化。 实验内容 实验培训中纯化的目标蛋白为在BL21（DE3）菌株中表达的带His标签的可溶融合蛋白，蛋白由IPTG诱导表达，通过超声破碎法裂解细菌得到粗蛋白，在通过亲和层析、蛋白酶切、离子交换层析技术获得纯度达90%以上的目标蛋白。 实验材料： 1.仪器： 高速冷冻离心机、恒流泵、蛋白核酸检测仪（见图1）、电泳仪、pH计 图1 2.层析柱： IMAC预装柱、Q预装柱、SP预装柱 3.试剂： Tris、NaCl、Imidazole、Ni2SO4、EDTA、NaOH、重组肠激酶Enterokinase 实验方法： 诱导表达 加入量为：1ml菌液加入1μl 0.5mIPTG，37℃诱导3h. 破菌 破菌buffer：20mM Tris 250mM NaCl 10mM Imidazole,pH 8.0 20:1(ml/g)比例用破菌buffer重悬菌体，Φ10探头400W超声4s,停止6s，循环99次。中间暂停一次搅拌均匀。破菌液12000rpm离心20min。 亲和层析： Column：IMAN预装柱（规格1ml） Buffer A：20mM Tris 250mM NaCl 10mM Imidazole,pH 8.0 Buffer B：20mM Tris 250mM Na