实验十植物的组织培养-大连理工大学精品课程.ppt

实验十 植物的组织培养 1.实验目的 学习植物组织培养常用固体培养基的配制。 学习和掌握植物外植体表面消毒的常规方法； 掌握植物无性繁殖技术。 2.实验原理 植物组织培养定义：植物组织培养是指将离体的植物器官，组织，细胞等在模拟机体自然生理条件下在体外进行培养，使之生存或生长成为完整植株的技术。 植物组织培养的应用：快速繁殖；去病毒，苗木复壮；改种、育种及保种；基础研究中的应用。 理论依据：植物细胞的全能性。 细胞或组织脱分化→愈伤组织→再分化 。 愈伤组织：一团由组织增生的细胞产生的不定形的疏散排列的薄壁细胞团，无明显的组织或器官的分化 。 3.实验材料、用品 实验材料：胡萝卜块根、烟草叶片 实验用品 ①仪器及用具 电子天平、高压灭菌锅、冰箱、超净工作台、酒精灯、记号笔、镊子、剪刀、解剖刀、无菌烧杯或三角瓶、无菌培养皿、无菌滤纸、装有培养基的培养容器 pH试纸，烧杯，量筒，试剂瓶，三角瓶，洗耳球，刻度吸管，洗瓶。 ②试剂与药品 硝酸胺，硝酸钾，磷酸二氢钠，硫酸镁，氯化钙，硫酸铁，乙二胺四乙酸等（见表6-1），2，4-D，BA，盐酸，1 mol/L氢氧化钠、0.1%氯化汞、75%乙醇、无菌水。。 4.实验步骤 （1）MS培养基的配制与灭菌 （2）植物外植体取材、消毒和接种 ①接种前，用75%乙醇棉球或用2%苯扎溴铵溶液檫拭超净工作台台面，将培养基及用具放入工作台，开超净工作台紫外灯照射至少20min，然后开送风开关，关闭紫外灯，通风10min后，再开日光灯进行无菌操作。 ②自大田中选取无病、无虫、生长健壮的烟草叶片及胡萝卜块根，带回实验室，在自来水下冲洗干净，用剪刀剪切去外围组织。 ③将材料带入工作台，切成小块分别放无菌烧杯或三角瓶中，加入75%乙醇溶液浸泡30s，然后倒出酒精，加入0.1%氯化汞溶液，分别浸泡2、5、10min，期间不断摇动。然后倒去升汞，用无菌水洗涤3-5次。 ④点燃酒精灯，用酒精棉球擦拭手臂。取出培养皿，剪刀和镊子使用前插入90%乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却后，用镊子将材料取出，放在无菌滤纸上吸干水分；将材料切成0.5×0.5cm大小的小块。 ⑤将培养容器放在左手中。将塞盖用右手打开。用火焰灼烧瓶口，灼烧时应不断转动瓶口。用镊子将切好的材料接入培养瓶内的培养基上，每瓶放2-3块。重新盖上瓶盖，封口，贴上标签，标明培养基代号、接种时间和材料名称。 ⑥将培养瓶放入培养室，于25℃±2℃、3000lux光照条件下培养。定期进行观察。实验结果 5.实验结果 观察接种材料（叶片、或胡萝卜肉质根）接种后2～5天的污染情况。如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短；若接种材料虽然没有污染，但材料已发黄，组织变软，表明消毒时间可能过长，组织被破坏死亡；接种材料若没有出现污染，生长正常，即可以认为消毒剂使用的浓度的及消毒时间适宜。 培养1周左右，可见沿外植体伤口边缘长出愈伤组织，3-4周后从愈伤组织中分化出许多丛生不定芽。 6. 注意事项 配制MS培养基时要特别注意pH, 若pH小于5.4，则培养基不会凝成固体。 要特别注意消毒外植体的时间，它是实验成败的关键。 7.思考题 简述植物的试管快速繁殖技术的整个过程。 外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗?为什么常在消毒溶液中加入1～2滴表面活性剂（如吐温）? 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 指导教师：唐颖 5000 100 肌醇 25 0.5 烟酸 25 0.5 盐酸吡哆素 20 0.4 盐酸硫胺素 10 500 100 100 2.0 甘氨酸 有机物质 2780 27.8 FeSO4·7H2O 10 1000 3730 100 37.3 Na2-EDTA 铁盐 2.5 0.025 CoCl2·6H2O 2.5 0.025 CuSO4·5H2O 25 0.25 Na2MoO4·2H2O 83 0.83 KI 620 6.2 H3BO3 860 8.6 ZnSO4·7H2O 10 1000 2230 100 22.3 MnSO4·4H2O 微量元素 8800 440 CaCl2·2H2O 3400 170 KH2PO4 7400 370 MgSO4·7H2O 33000 1650 NH4NO3 50 1000 38000 20 1900 KNO3 大量元素 配1L培养基吸取量（mL） 母液定容体积（mL） 称取用量（mg） 扩大倍数 规定用量（mg/L） 成分 母液种类 * * * 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院