逆转录聚合酶链反应中的细节问题.pptVIP

PCR反应条件的优化 （一）PCR反应的缓冲溶液 提供合适的酸碱度和某些离子 10～50mmol/L Tris-HCl缓冲液 50mmol/L KCl BSA或明胶 （二）镁离子浓度 Taq酶活性需要Mg2+ ， Mg2+浓度过高导致非特异扩增。 一般常用1.5mmol/L 三）底物浓度 dNTP浓度在20～200 ?mol/L 四种dNTP必须浓度相等 （四） Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在70～80℃具有最高聚合活性 （五）引物 引物浓度一般为0.1～ 0.5?mol/L （六）反应温度和循环次数 变性温度和时间 95℃/30 ～60s 退火温度和时间 45～55℃/30 ～60s 延伸温度和时间 72℃ 60s 循环次数 25～30 不超过35 Sense:5 ACCTCCGACGCCAAGTGA 3‘ Anti-sense:5 CGGTTCCCAAATAATACGC 3 4、引物同源性分析（用Blast进行同源性比较） 检查引物的特异性 3、Primer Premier 5.0设计的大鼠olig2引物 5、Blast进行同源性比较，确认引物的特异性后，联系公司，合成引物 6、引物的溶解和稀释 上下游引物干粉各加适量消毒双蒸水(灭菌注射用水)稀释至20μM, -20℃保存. PCR举例 注