SYBRGreenI荧光定量PCR.ppt

实时荧光定量PCR的应用 杨阳 2.11-08-31 主要内容 第一部分：PCR简介 第二部分：RNA的提取 第三部分：RT 第四部分：实时荧光定量PCR 第五部分：数据分析 第六部分：误差校正 第七部分：常见问题分析 第一部分：PCR简介 PCR技术的发明 v 1985年Kary.B.Mullis教 授发明了具有划时代意义的 PCR技术。 PCR Polymerase Chain Reaction vPCR (聚合酶链式反应)技术是一种体外快速扩增特定DNA片段的方法。 v 是一个在引物介导下反复进行热变性、退火、引物延伸三个步骤而扩增DNA的循环过程。 v运用PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的DNA片段，使皮克(Pg，10－12）起始物达到微克（μg，10－6）水平。 2.PCR原理 PCR类型 RT-PCR 兼并引物PCR 巢式PCR 反向PCR 不对称PCR 原位PCR 实时荧光定量PCR技术real-time fluorescent quantitativePCRFQ-PCR 是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃。 实时荧光定量PCR技术分类 荧光探针 Beacon法：以美国人Tagyi为代表 TaqMan探针:以美国ABI公司为代表 FRET技术:以罗氏公司为代表 荧光染料 饱和荧光染料: EvaGreen、LC Green 非饱和荧光染料:SYBR GreenⅠ 第二部分：RNA的提取 提RNA基本步骤 RNA的抽提注意事项 所有用具去RNase处理 戴口罩、帽子，勤换手套，防外源RNase污染 尽量快速 4 ℃离心：室温会导致不适当分层，从而导 致变异RNA产物。 RNA的抽提注意事项 一、标本的处理 新鲜、低温保存、避免反复冻融。易至RNA降解，提取量下降。 二、匀浆：Trizol 裂解细胞，使核蛋白体解离，释放RNA；抑制RNase活性；酸性酚使RNA进入水相。 过多：上清液变为红色，浪费。 过少：未加氯仿前即分层。 裂解不充分， RNase抑制不充分，得率低，RNA完整性、纯度受损。 三、抽提、分层：氯仿 变性蛋白，抽提去除过多的酚，加速有机相与水相的分层。 过少：上述作用减弱，影响RNA质量。 过多：使DNA和蛋白进入水相，影响RNA质量。 四、沉淀：异丙醇 过多：会沉淀盐和其他污染物，使用乙醇不能洗脱。 五、洗涤： 75%乙醇 去盐作用，根据情况可重复几次。 六、溶解： DEPC水 掌握溶解时间。 太早：沉淀物太湿，含有乙醇会影响后续反应。 太迟：沉淀物太干，不易溶解。 RNA的质量 RNA得率检测——分光光度计 260nm:核酸 280nm:蛋白等有机体 230nm:杂质浓度 320nm:溶液浑浊度 总RNA浓度（ng/μl） =OD260×40×稀释倍数（ng/μl） OD 260读数介于0.1～1.0之间可靠 （20～3200 ng/μl ） RNA的质量 RNA完整性鉴定 第三部分：RT RT反应体系 RNA 1μg Primer 1μL 5×Reaction Buffer 4μL RNase inhibitor（20U/μL） 1μL 10mM dNTP mix 2μL Reverse Transcriptase（200U/μL)1μL DEPC-treated water up to 20μL RT引物的选择 RT反应条件 25℃,5min ；(随机引物加此步) 42℃,60min； 70℃,5min。 RT反应的注意事项 冰上操作 配制混合液 试剂短暂离心 移液枪：用完之后要归到最大计量的位 置，防止久而久之弹