RT-PCR定量PCR-郭卫.pptVIP

荧光定量PCR技术原理及应用 REAL-TIME PCR 复习普通PCR RT-PCR What is Real-Time PCR? What is Real-Time PCR? What is Real-Time PCR? 所谓实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量和定性分析 在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，产物不断积累，荧光信号强度也等比增加。通过检测荧光强度的变化，我们就可以得到荧光扩增曲线 What is real-time PCR? Other benefits… 如 何 定 量 ? 扩增曲线分成三个阶段：背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。 为了达到定量的目的，荧光定量技术引入两个非常重要的概念：荧光阈值（Threshold）和CT。 荧 光 染 料 SYBR Green 法 --PCR反应的建立 SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同 SYBR Green 法应用范围 起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 TaqMan探针 TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增有关。 探针5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团。 利用了PCR延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性，使荧光基团和淬灭基团分离。 TaqMan Probe TaqMan Probe 原理 TaqMan Probe 原理 TaqMan Probe 原理 TaqMan 法 PCR反应的建立 1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的确定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃， 30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高）也可通过温度梯度优化退火温度 72 ℃，45 S 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同 TaqMan 法 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP分析 分子信标（Molecular Beacon） 分子信标是一种在靶DNA不存在时，形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。 发夹结构的两端分别连接荧光基团和淬灭基团。 利用分子构象的改变使得荧光基团和淬灭基团分开。 Molecular Beacon 两种定量目标 绝对定量的标准样品 已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA 相对定量中的内标 内标通常是18S、β-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境 因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释 TaqMan SNP分析 影响定量PCR结果的因素 产物特异性 Real time PCR 使用 SYBR Dye 的话，对 PCR 产物的特异性要求非常高。 SYBR 与所有 dsDNA结合，包括引物二聚体。 理想情况是引物设计非常完美，各种试剂的使用量恰到好处，温度变化与“变性，退火，延伸”完全吻合，使得 PCR过程中产生极少引物二聚体，极少有偏差的延伸，极少非目的模板的扩增。 影响定量PCR结果的因素 移液必须准确 防止污染，如环境中的 DNA进入反应管 出现引物二聚体，除了寻找合适的序列，还可以改变退火温度，限制引物的浓度 Mg2+浓度，可以从 2mM 到 5mM 做梯度实验 退火/延伸温度，可以从 60℃到 72℃做梯度实验 模板浓度适量 双Taqman探针法检测野生型和突变型 在基因型